第五章花药和花粉

第五章花药和花粉培养第一节植物花药和花粉培养的概念和应用第二节花药和花粉培养方法

第三节单倍体植株鉴定和染色体加倍花药单倍体胚状体本文档共41页；当前第1页；编辑于星期二\20点9分要求了解植物的花药和药粉培养概念及应用，单倍体植株鉴定和染色体加倍技术；掌握植物的花药和花粉培养技术。讲解重点植物的花药和花粉培养技术及影响因素。本文档共41页；当前第2页；编辑于星期二\20点9分第一节植物花药和花粉培养的概念和应用自1964年Guha和Maheshwari首次获得

曼陀罗单倍体植株以来，已有250多种高等植物通过花药培养得到了单倍体植株。其中有近1/4的植物种类的花粉植株是在我国首次培养成功的，包括比较困难的禾本科作物。中国首先应用单倍体育种法改良作物品种，

已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种。

本文档共41页；当前第3页；编辑于星期二\20点9分花药（anther）是植物花的雄性器官，包括二倍体的药壁和药隔组织、单倍体的雄性细胞——花粉粒。（pollengrain）一、花药和花粉培养的概念本文档共41页；当前第4页；编辑于星期二\20点9分花药和花粉培养是指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而象体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株的。花药培养是将一定发育期的花药进行离体培养的技术，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养是将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。本文档共41页；当前第5页；编辑于星期二\20点9分目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。作物单倍体只具有单套染色体组，不能结实，本身无利用价值，但经染色体加倍成为双单倍体（doublehaploid，DH），与常规育种有机结合，就会显示出巨大的优势。二、花药和花粉培养的应用本文档共41页；当前第6页；编辑于星期二\20点9分◆育种材料可以缩短育种年限

常规育种中，杂交F2代起会出现性状分离，到F6代才开始选择，育成一个品种需8-10年。单倍体育种中，通过F1代花药培养，获得单倍体植株，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，

育种只需3-5年，显著缩短育种年限。◆突变系的筛选对花粉进行诱变处理，经离体培养获得单倍体植株，其表现型和基因型一致，突变（无论是显性或是隐性的）在当代植株中就会表现出来。

◆花药培养和抗病育种结合起来，导入抗病基因，是培育抗病品种的有效方法之一。1.作物育种本文档共41页；当前第7页；编辑于星期二\20点9分2.

物种进化研究利用单倍体材料可查明其原始亲本染色体组的构成。单倍体植物减数分裂时，形成二价体染色体的可能性及其数目和形状，能够说明有无同源染色体，如发现大量的二价体，同时植株表现高度可育性，说明核内有相同的染色体组，此单倍体植株则是多倍体。本文档共41页；当前第8页；编辑于星期二\20点9分3.

遗传分析

单倍体是研究基因性质及其作用的良好材料。

目前在许多植物上应用植物单倍体培养技术

已构建出DH群体（单倍体加倍获得的双单倍体），

并用于遗传分析。以小麦DH群体（旱选10号×鲁麦14）为材料，在水分胁迫及非胁迫两种条件下考察水培幼苗的单株根数、最大根长、根鲜重、根干重、

根茎鲜重比及根茎干重比等根系性状。应用基于混合线性模型的复合区间作图法

分析幼苗根系性状的QTL，以及基因与环境的互作。本文档共41页；当前第9页；编辑于星期二\20点9分4.分子生物学为构建RFLP和RAPD连锁图，需要建立合适的作图群体（大致分为4类）（1）基于单交产生的F2群体

F2易配制，提供给遗传分析的信息最为丰富，可以估计加性效应和显性效应，但是F2

提供的种子有限，很难进行连续性研究。

（2）回交（BC）群体陈冰嬬，石英尧，崔金腾，等.利用BC2F2高代回交群体定位水稻籽粒大小和形状QTL.作物学报，2008,

34(8):

1299−1307

暂时性群体本文档共41页；当前第10页；编辑于星期二\20点9分（3）重组自交系群体（RIL）；

经过连续多代自交或姊妹交产生的，这使得染色体间重组机会增加，因而可以用来更精确地定位那些紧密连锁的位点；

另外它可以连续提供家系内遗传上一致的种子，

因此可以进行重复区组试验，把区组效应、重复效应和随机误差最小化或分解开来，检测QTL的准确性增加。但是构建这样的群体需要很长时间，而且不能估计显性效应。

（4）DH群体（双单倍体群体）

。F1杂种水稻植株，取花药，培养再生植株，秋水仙素处理，移栽，开花期套袋自交，单株收获种子。

永久性群体

本文档共41页；当前第11页；编辑于星期二\20点9分近等基因系

以上群体在QTL定位方面存在共同局限性，即对QTL的精确定位能力不强，如果要精细定位QTL

，那么最好的研究群体是近等基因系。近等基因系基本特征是整个染色体的绝大部分区间完全相同，只在一个或少数几个区间彼此存在差异，因此它能使整个基因组间的多个QTLs分解为只存在一个或几个QTLs分离，消除其它背景干扰消除主效QTL对微效QTL效应的掩盖作用，对QTL精细定位很有帮助。本文档共41页；当前第12页；编辑于星期二\20点9分5.植物基因克隆筛选把已知的转座基因转化异源植物，通过转座因子标签法定向诱导突变体，已成为克隆植物基因的有效途径之一。关键：筛选到转座因子引起的表型突变体。单倍体可直接表达隐性基因的性状，更适合在细胞水平筛选突变体。本文档共41页；当前第13页；编辑于星期二\20点9分花粉小孢子发育途径正常发育途径：形成花粉。离体发育途径——花粉孢子体发育途径：花粉或小孢子沿孢子体发育途径发育成花粉植株的过程称为雄核发育。小孢子营养核生殖核营养核退化生殖核退化共同分裂复制后核融合C2个相似营养核重复分裂核融合后重复分裂单倍体胚2倍体胚3倍体胚4倍体胚单倍体胚多倍体胚不均等分裂均等分裂AB本文档共41页；当前第14页；编辑于星期二\20点9分花粉离体培养的发育单核小孢子第一次有丝分裂

A途径（单倍体）

花粉进行不对称分裂，形成一个大的营养细胞和小的生殖细胞，接着分裂形成胚或愈伤组织。

B途径（单或多倍体）

花粉进行对称分裂，细胞相似于营养细胞，发育成胚状体或愈伤组织。

C途径（非单倍体）

生殖细胞与营养细胞同时发育，核融合形成胚状体。本文档共41页；当前第15页；编辑于星期二\20点9分一、花药培养1.材料的选取关键在于选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂至双核期的花药，均有可能诱导离体雄核发育。花粉的发育时期：四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉

最适期（单核晚期-双核晚期）第二节花药和花粉培养方法*本文档共41页；当前第16页；编辑于星期二\20点9分预处理，增加绿苗产量。

（1）高、低温处理常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长短因植物种类而异。水稻：5-10℃，3-12d；

35℃，15min。小麦：1-5℃，2-7d；

35℃，8d

2.材料预处理低温处理的作用

1）可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；

2）保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；

3）激发花粉产生原胚；

4）促使细胞同步分裂。本文档共41页；当前第17页；编辑于星期二\20点9分（2）化学物质处理◆高糖：高糖预处理提高愈伤组织和胚状体的诱导率。提高愈伤诱导：玉米，25%蔗糖，6-8min。◆甘露醇：处理造成小孢子饥饿，引起脱分化。◆秋水仙素：导致均等分裂。◆乙烯利：诱导额外分裂，使多核花粉增多。（3）其他◆射线：诱导愈伤组织形成。◆离心：重力作用影响小孢子发育，提高单倍体植株诱导率。◆磁场：提高愈伤组织诱导率。

本文档共41页；当前第18页；编辑于星期二\20点9分3.

消毒3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉）-70%酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。本文档共41页；当前第19页；编辑于星期二\20点9分4.

接种与培养镊子剥去花瓣---花药均匀接种于培养基上，常用培养基MS、N6和马铃薯培养基。蔗糖5-10%，可固体培养或液体培养。

20-30℃，光照12h。本文档共41页；当前第20页；编辑于星期二\20点9分5.

花药培养下花粉的发育（1）愈伤组织-植株禾本科植物通常不能形成胚状体。培养基中含2,4-D（1-2mg/L)，花粉粒诱导愈伤组织；愈伤组织生长10-15天，直径时转入器官分化培养基（不含2，4-D

，含NAA和KT各0.5mg/L），分化根、芽。（降低生长素与蔗糖浓度，提高细胞分裂素）倍性混乱本文档共41页；当前第21页；编辑于星期二\20点9分（2）胚状体-植株

烟草花药在无激素培养基上，

3周后在花药在花药开裂处可见许多淡黄色胚状体，见光后转绿，逐步长成小苗。单核期或单核中晚期。多为单倍体。

本文档共41页；当前第22页；编辑于星期二\20点9分6.壮苗和移栽小麦（王培等）2-3片叶转入MS+多效唑3mg/L+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+水解乳蛋白LH500mg/L+蔗糖8%22-25℃壮苗然后3-8℃低温弱光越夏深秋炼苗移栽。7.单倍体植株的加倍人工加倍，秋水仙素0.02-0.4%本文档共41页；当前第23页；编辑于星期二\20点9分草莓花药愈伤组织草莓花药再生植株本文档共41页；当前第24页；编辑于星期二\20点9分花粉培养比花药培养优越：从较少的花药得到大量的花粉植株；不存在体细胞干扰；没有混倍现象，便于生理生化研究。二、花粉培养本文档共41页；当前第25页；编辑于星期二\20点9分（一）花药预培养适合的花蕾-有滤纸的培养皿中-5℃几天-灭菌-取出花药-接种于培养基中数天-将花粉分离-悬浮培养。本文档共41页；当前第26页；编辑于星期二\20点9分1．取材时期的确定四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期

小孢子花粉粒

花粉培养花药培养大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的是单核期或单核中晚期。（二）花粉培养本文档共41页；当前第27页；编辑于星期二\20点9分适合的花蕾-消毒-取出花药-烧杯壁中挤压花药-尼龙网过滤-花粉液离心-花粉粒沉淀-培养基稀释-纯净花粉群体。（1）自然散落法（2）挤压法取出花药，放在加有液体培养基的小烧杯中，用粗的玻棒，在烧杯壁上挤压花药室，使花粉从花药中释放出来.（3）机械游离

◆磁搅拌法

◆小型搅拌（超速旋切）法2.花粉的分离与纯化本文档共41页；当前第28页；编辑于星期二\20点9分（4）小孢子分离和纯化

根据不同植物花粉粒的大小，选用孔径大小合适的尼龙网（孔径20-60µm）过滤，除去药壁组织.

过滤后的花粉液在低速离心（100-160转/分）3min，使花粉粒沉于离心管下部，再用新鲜培养基稀释，重复两次，可得到纯净的花粉群体.本文档共41页；当前第29页；编辑于星期二\20点9分（1）平板培养（platecultivationmethod）花粉置琼脂固化培养基上进行培养，诱导产生胚状体，进而分化成植株。（2）液体培养易造成通气不良。（3）固体-液体双层培养基培养液体培养基在上层。（4）看护培养（nursecultivationmethod）将完整的花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或花药愈伤组织上，然后将花粉置于滤纸的上方。3.花粉培养方法本文档共41页；当前第30页；编辑于星期二\20点9分（5）微室培养（microchamberculturemethod）

大、小玻璃片做成微室，倒悬培养。（6）条件培养基培养(conditionedmediummethod)

预先培养了花药的培养基（含有花药提取物）上培养花粉，可促进花粉发育，有利于花粉培养成功。本文档共41页；当前第31页；编辑于星期二\20点9分1.基因型植物基因型是影响离体诱导单倍体成功的最重要的因素之一。水稻：糯>粳>粳/籼>籼>籼/籼，糯稻花粉愈伤组织诱导率10%。

裸子植物较难。2.植物生长条件和生理状态植株的生长条件（如光周期、光强、温度和矿质营养）和生理状态是影响雄核发育的又一重要因素。一般来说，取相对年幼植株上开花始期的花比开花末期的花更适当，开花早期较好。三、影响雄核发育和花粉花药培养的因素*本文档共41页；当前第32页；编辑于星期二\20点9分3.花粉发育时期

花药接种前一般需要先用醋酸洋红染色压片镜检，以确定花粉的发育时期。不同植物差别较大。4.药壁因子

许多研究表明，在花粉胚发育过程中花药壁起着重要作用。药壁看护培养本文档共41页；当前第33页；编辑于星期二\20点9分5.培养基（1）基本培养基

禾谷类作物-朱至清N6；烟草-H；小麦-王培C17、欧阳文俊W14等。高浓度的铵离子抑制花粉愈伤组织形成。（2）碳源

蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等都曾用于不同植物的试验，葡萄糖提高小麦花粉胚的诱导频率。

蔗糖浓度单子叶（水稻3-6%，小麦6-10%，玉米12-15%）>双子叶（3%）本文档共41页；当前第34页；编辑于星期二\20点9分（3）氨基酸和其他有机物质天然有机附加物可提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率，促进生长。

（4）植物激素

不同植物对种类和量的需求不同，生长素促愈伤组织形成，

2，4-D诱导愈伤，但抑制愈伤组织分化成胚状体。（5）活性炭（0.5%）较强的吸附作用，促进花粉分裂。（6）pH曼陀罗5.8；油菜6.2；小麦，诱导愈伤5.6，绿苗分化6.1。本文档共41页；当前第35页；编辑于星期二\20点9分温度：比愈伤要求更高；光照：红光有利；小孢子植板密度：影响很大6.培养条件本文档共41页；当前第36页；编辑于星期二\20点9分第三节单倍体植株的染色体加倍一、花粉和花药植株的倍性鉴定1.染色体直接计数法

根尖或茎尖。2.间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（又称流式细胞仪

flowcytometry，FCM）

DNA含量（2）细胞形态学鉴定

叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数、保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高