治带片中苦参碱及氧化苦参碱的HPLC法测定

治带片中苦参碱及氧化苦参碱的HPLC法测定【摘要】目的建立治带片中苦参碱及氧化苦参碱的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法色谱柱：LichrospherNH2(×250mm，5μm)，C18保护柱；流动相：乙腈无水乙醇/L磷酸水溶液(80∶10∶10)；检测波长212nm；流速/min；柱温：室温；进样量20μL。结果苦参碱和氧化苦参碱线性范围均为μg/mL，回归方程苦参碱为：C=×10-4A+，r=；氧化苦参碱为：C=×10-4A+，r=，平均回收率分别为%和%，RSD分别为%和%。结论本法简便快捷，结果准确，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】治带片；苦参碱；氧化苦参碱；高效液相色谱

DeterminationofAlkaloidsinZhidaipianTabletsbyhighperformanceliquidchromatogram

ABSTRACT:ObjectiveToestablishamethodofhighperformanceliquidchromatogram(HPLC)formeasuringmatrineandoxymatrineinZhidaipianTablets.MethodsALichrospherNH2column(×250mm,5μm)wasusedwithamobilephaseconsistingofacetonitrileethanol/Lphosphoricacid(80∶10∶10),andinaflowrateof/min.Thedetectivewavelengthwas212nm.Columntemperaturewasroomtemperatureandtheinjectionquantitywas20μL.ResultsThesampleswerewellseparated.Thelinearrangewasthesameforthetarget(μg/mL).ThelinearequationsformatrinewasC=×10-4A+,thecorrelationcoefficientwas,andforoxymatrinewasC=×10-4A+,whilethecorrelationcoefficientwas,respectively.Themeanrecoveryratewere%and%,respectively.RSDwas%and%,respectively(n=6).ConclusionThemethodissimple,reliable,accurateandcanbeusedtothequalitycontroloftheZhidaipianTablets.

KEYWORDS:Zhidaipiantablets;matrine;oxymatrine;highperformanceliquidchromatogram

治带片处方由墓头回、苦参、金樱子、知母(盐炒)、苍术(炒)等组成。清利湿热，止带。用于湿热下注，赤带，白带，黄带等症。方中苦参为君药，其有效成分是苦参碱和氧化苦参碱。为有效控制药品质量,对制剂中的苦参碱和氧化苦参碱采用高效液相色谱(HPLC)法进行含量测定。

1材料与方法

仪器与试药日本岛津LC10AT高效液相色谱输液泵，SPD10AVP紫外可见检测器，岛津7725i进样器，ANASTAR色谱工作站，DL360超声波清洗器(浙江象山县石浦海天电子仪器厂，功率240W，频率35kHz)，乙腈、无水乙醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。苦参碱和氧化苦参碱对照品由中国药品生物制品检定所提供(编号分别为110805200306和0780200004)，供含量测定用。治带片由西安阿房宫制药有限公司提供(批号20030611-20030613)。

对照品溶液的配制精密称取苦参碱、氧化苦参碱对照品适量，用乙腈无水乙醇(8∶1)溶解，分别制成/mL溶液作为苦参碱、氧化苦参碱对照品储备液。

供试品溶液的制备取治带片2片，研细，称，于100mL磨口锥形瓶中，加入20mL氯仿及浓氨液，密塞，称定重量。超声处理30min，放冷，用氯仿补足失去的重量，摇匀、过滤，取续滤液5mL，通过中性氧化铝柱(100-200目5g，装前于高温电炉400℃处理2h，冷却后装于内径1cm层析柱中)。依次用氯仿、氯仿甲醇(7∶3)各20mL洗脱，合并洗脱液，挥去并赶尽溶剂，残渣用乙腈无水乙醇(8∶1)溶解并定容至，测定时再用乙腈无水乙醇(8∶1)稀释5倍并过μm微孔滤膜，取续滤液测定。

阴性对照溶液的制备依处方工艺制成不含苦参药材的片剂，再按方法制成阴性对照溶液。

2结果

色谱条件色谱柱LichrospherC18(×250mm，5μm)，C18保护柱(部件号：011200002)；流动相为乙腈无水乙醇/L磷酸水溶液(80∶10∶10)，使用前经μm微孔滤膜过滤并脱气；检测波长212nm；流速/min；柱温：室温；进样量20μL。在此条件下，对照品、供试品及阴性对照溶液的色谱图如图1所示。

图1治带片HPLC色谱图(横坐标为时间：min)

HPLCgraphsofmatrineandoxymatrineinZhidaipianTablets

a:Standard;b:Sample;c:Blank;1:Matrine;2:Oxymatrine

线性关系考察用乙腈无水乙醇(8∶1)稀释为分别含10μg/mL的苦参碱和氧化苦参碱的对照品溶液，制成含、、、、、μg/mL苦参碱和氧化苦参碱的对照品溶液，进样，测定。以峰面积A对对照品溶液的浓度C作曲线，进行线性回归，回归方程苦参碱为：C=×10-4A+，r=；氧化苦参碱为：C=×10-4A+，r=。说明苦参碱和氧化苦参碱质量浓度在μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

供试品溶液制备方法的考察实验采用正交法对氯仿体积、超声时间、氧化铝重量等影响因素进行了考察。

因素水平A氯仿体积(mL)：A1=10，A2=20，A3=30。B超声时间(min)：B1=15，B2=30，B3=45。C氧化铝重量(g)：C1=3，C2=4，C3=5。

实验方法及结果精密称取研细的同批号相同重量供试品于100mL磨口锥形瓶中，分别按L9(34)正交表(表1)进行试验，测定苦参碱峰面积(ofmatrine)和氧化苦参碱峰面积(ofoxymatrine)，用统计软件进行分析处理，结果见表2-4。

供试品溶液制备条件的优化上述实验结果表明，对苦参碱而言，因素A、C对实验结果均无显着性影响()，B对结果有显着性影响()，B1与B2、B3间有显着性差异()，B2、B3间无显着性差异()；对氧化苦参碱而言，因素A、B、C对实验结果均无显着性影响()。考虑到实验操作便易等因素，供试品溶液最佳提取工艺为A2B2C3。

表1苦参碱和氧化苦参碱提取方法正交试验L9(34)表

Table1Theresultsoforthogonaltestforextractiontechnologyofmatrineandoxymatrine

表2苦参碱提取方法多因素方差分析

Table2Testsofbetweensubjectseffectsforextractiontechnologyofmatrine

表3苦参碱不同超声时间提取的方差分析表

Table3Multiplecomparisonsofdifferentultrasonicextractingtimesofmatrine

表4氧化苦参碱提取方法多因素方差分析

Table4Testsofbetweensubjectseffectsforextractiontechnologyofoxymatrine

精密度试验按方法制备一份样品，重复进样5次，每次20μL，按色谱条件测定峰面积，结果苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值的RSD分别为%和%。

稳定性试验按方法制备一份样品，分别于0、2、4、6、8h精密吸取20μL，按色谱条件测定，记录峰面积积分值，结果苦参碱、氧化苦参碱峰面积积分值的RSD分别为%和%，表明供试品溶液在8h内稳定。

重复性试验取同批样品5份，按方法制备供试品并按色谱条件测定，结果苦参碱、氧化苦参碱质量分数的RSD分别为%、%。

回收率试验采用加标回收法。取已知含量的同批样品数片，研钵中研细，称重6份，分别精密加入苦参碱和氧化苦参碱对照品，按方法制备样品并按色谱条件测定。结果苦参碱和氧化苦参碱的平均回收率分别为%和%，RSD分别为%和%(表5)，表明回收率良好。

表5治带片中苦参碱和氧化苦参碱回收率试验结果

Table5ResultsofrecoverytestformatrineandoxymatrineinZhidaipiantablets

样品测定按方法及方法分别测定不同生产批号的三批样品，结果三批样品含苦参碱和氧化苦参碱总量在/g之间。按每片计，每片含苦参碱和氧化苦参碱总量在之间。

3讨论

苦参中苦参碱的含量测定药典以薄层扫描法测定[1]。本文参照文献[25]，在碱性条件下，用氯仿提取苦参碱后，过中性氧化铝柱以消除其他干扰成分，并比较了不同氧化铝的处理方法对消除干扰成分的效果，试验证明，氧化铝在400℃高温电炉里处理2h后，效果更好。应用HPLC，以LichrospherNH2柱(×250mm)为固定相，乙腈无水乙醇磷酸水溶液为流动相，同时测定苦参碱和氧化苦参碱含量。通过正交L9(34)试验对氯仿体积、超声时间、氧化铝重量等影响苦参碱和氧化苦参碱提取的因素进行了考察，为测定治带片中苦参碱和氧化苦参碱的含量提供了一个可靠的方法。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2000版一部.北京：化学工业出版社,2000:161.

陈发奎.常用中草药有效成分含量测定[M].北京：人民卫生出版社,1997:390395.

邹桂欣，尤献民，姜鸿，等.龙参颗粒的质量标准研究[J]