生化制药基本技术演示文稿

生化制药基本技术演示文稿本文档共83页；当前第1页；编辑于星期三\13点3分优选生化制药基本技术本文档共83页；当前第2页；编辑于星期三\13点3分生物材料、发酵或培养液↓预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）↓细胞分离（沉降、离心、过滤）↓细胞↓细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）↓收集上清液↓初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）↓高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）↓成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）图2-1生化药物提取的一般工艺流程上清液（含胞外产品）本文档共83页；当前第3页；编辑于星期三\13点3分一、原料的选取与保存

选择原则：①有效成分含量高，原料新鲜；②原料来源丰富，易得，原料成本低；③原料中杂质含量较少等。植物材料确定后，要选择合适的季节、地点、时间后采集并就地去除不用的部分，将有用的部分保鲜处理。保存生物材料的方法主要方法有冷冻法，常用-40℃速冻；有机溶剂脱水法；防腐剂保鲜法。本文档共83页；当前第4页；编辑于星期三\13点3分二、生化药物提取1.物理性质与提取提取是利用目的物的溶解特性，将其与细胞的固形成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞内的生理状态转入特定溶液环境的过程。许多生化药物具有生物活性，其稳定性受pH、温度、离子强度、金属离子、提取过程中所使用的溶剂等环境因素的影响。

本文档共83页；当前第5页；编辑于星期三\13点3分2.提取的溶剂系统（1）对水溶性、盐溶性生物物质的提取可用酸、碱、盐水溶液为提取剂。（2）对水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取可用表面活性剂或有机溶剂提取，用有机溶剂作为提取试剂时，根据产物存在的状态可分为液-液提取和固-液提取。本文档共83页；当前第6页；编辑于星期三\13点3分①液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。杂质溶质原溶液萃取剂LightphaseHeavyphase萃取相原溶液tC本文档共83页；当前第7页；编辑于星期三\13点3分在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称为分配系数。在常温下Ｋ为常数；Ｃ的单位通常用mol/L或质量单位/mL。本文档共83页；当前第8页；编辑于星期三\13点3分工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。表2青霉素在不同萃取剂中的分配系数

溶剂pH2.5（溶剂/水）pH7.0（溶剂/水）乙酸戊酯45/11/235乙酸丁酯47/11/186乙酸乙酯39/11/260氯仿39/11/220三氯乙烯21/11/260乙醚12/11/190本文档共83页；当前第9页；编辑于星期三\13点3分物理化学方面有足够的容量与水溶液不互溶，不发生乳化对产物有高的分配系数低黏度在密度上同水有大的差别生物学方面在消毒过程中热稳定经济和毒理方面对生物催化剂、酶或活细胞无毒性低成本能大批供应对人员无毒不易燃表1在生物转化中萃取溶剂的选择准则本文档共83页；当前第10页；编辑于星期三\13点3分②固-液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂很重要，溶剂选择的主要依据是“相似相溶”原理。浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。无论采用哪种溶剂系统对目的物进行提取，在提取过程中都要尽量增加目的物的溶出度，并尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视目的物在提取过程中的活性变化。本文档共83页；当前第11页；编辑于星期三\13点3分三、细胞破碎技术植物细胞模式图本文档共83页；当前第12页；编辑于星期三\13点3分1.机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press等。JJ-2组织捣碎匀浆机

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珠磨法beadmill珠磨是常用的方法**细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机本文档共83页；当前第14页；编辑于星期三\13点3分超声波破碎仪

本文档共83页；当前第15页；编辑于星期三\13点3分技术原理效果成本破碎率举例高压匀浆法(孔型)须使细胞通过小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中<50%细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠剪切碰撞剧烈便宜90%细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵<50%细胞悬浮液小规模处理***不同机械破碎方法的比较本文档共83页；当前第16页；编辑于星期三\13点3分2.非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等

酶溶法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。本文档共83页；当前第17页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第18页；编辑于星期三\13点3分四、固液分离固液分离的方法很多，有重力沉降、离心分离和过滤等。离心：借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。过滤：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。本文档共83页；当前第19页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第20页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第21页；编辑于星期三\13点3分第二节沉淀技术沉淀：是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。根据沉淀机理不同，可分为盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。本文档共83页；当前第22页；编辑于星期三\13点3分一、盐析法

水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内（0.15～0.2mol/L）最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象称为盐析。不同蛋白质盐析时所需的盐的浓度不同，因此调节盐的浓度，可以使混合蛋白质溶液中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。常用的盐析用盐包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等。本文档共83页；当前第23页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第24页；编辑于星期三\13点3分二、有机溶剂沉淀法

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂、降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法称为有机溶剂沉淀法。

许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。本文档共83页；当前第25页；编辑于星期三\13点3分三、等电点沉淀法

两性电解质在溶液pH处于等电点时，分子表面电荷为零，导致赖以稳定的电荷层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。调节溶液pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作称为等电点沉淀法。本文档共83页；当前第26页；编辑于星期三\13点3分第三节色谱技术色谱：也称层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起迁移速度不同而进行分离的方法。固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。本文档共83页；当前第27页；编辑于星期三\13点3分一、色谱技术的分类色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。根据固定相的形状不同，色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法。根据分离的机理，可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。本文档共83页；当前第28页；编辑于星期三\13点3分二、柱色谱装置和操作柱色谱一般由进样器、色谱柱、检测器、记录仪及部分收集器等部分组成。柱的分离效率与柱高成正比，与直径成反比。本文档共83页；当前第29页；编辑于星期三\13点3分柱色谱操作（1）装柱。根据欲分离的物质性质选择适宜的色谱介质，装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢加入，一次用完。然后用几倍柱床体积的缓冲液平衡色谱柱。（2）加样。将平衡后的色谱柱从柱顶部或底部进样。（3）洗涤。用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与固定相结合的杂质洗涤下来。（4）洗脱。根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将目的物洗脱下来。（5）再生。目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。本文档共83页；当前第30页；编辑于星期三\13点3分慢中等快柱分离淋洗液本文档共83页；当前第31页；编辑于星期三\13点3分三、吸附色谱固定相：固体为吸附剂，如硅藻土、硅胶、氧化钙、淀粉、活性炭等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：利用吸附剂对不同物质的吸附能力不同而使混合溶液中各组分相互分离的方法。本文档共83页；当前第32页；编辑于星期三\13点3分

混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。本文档共83页；当前第33页；编辑于星期三\13点3分在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因数Rf来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相的移动速度之比。Rf=溶质的移动速度/流动相的移动速度之比

=溶质的移动距离/流动相的移动距离之比本文档共83页；当前第34页；编辑于星期三\13点3分四、凝胶过滤色谱原理：按分子大小分离。凝胶为三维网状结构，可对大小流动产生不同的阻滞作用。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。

1.凝胶过滤色谱的分离机理固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；本文档共83页；当前第35页；编辑于星期三\13点3分2.凝胶的种类和性质（1）葡聚糖凝胶商品名为Sephadex，由葡聚糖和环氧氯丙烷在碱性条件下交联而成。主要型号是G-10～G-200。数字是凝胶的吸水量（每克干胶膨胀时吸水的毫升数）的10倍。（2）聚丙烯酰胺凝胶商品名为Bio-gel-P。主要型号有Bio-gel-P-2～Bio-gel-P-300等10种。后面的数字基本代表它们的排阻极限（不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量）的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。（3）琼脂糖凝胶（4）其他多孔玻璃珠和多孔硅胶等。本文档共83页；当前第36页；编辑于星期三\13点3分3.凝胶色谱的应用（1）脱盐及除去小分热源物质子杂质和溶液的浓缩。（2）浓缩。利用凝胶颗粒的吸水性可对大分子样品溶液进行浓缩。（3）生物大分子的纯化及生化药物中热源物质的去除。（4）分子量测定。在一定范围内，各个组分的洗脱体积Ve与其分子量的对数成线性关系。本文档共83页；当前第37页；编辑于星期三\13点3分五、离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。本文档共83页；当前第38页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第39页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第40页；编辑于星期三\13点3分六、亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。本文档共83页；当前第41页；编辑于星期三\13点3分薄层色谱原理2本文档共83页；当前第42页；编辑于星期三\13点3分纸层析原理本文档共83页；当前第43页；编辑于星期三\13点3分第四节结晶一、结晶的原理1.饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；2.过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

3.晶核：在过饱和溶液中，最先析出的微小颗粒就是以后结晶的中心，称为晶核。本文档共83页；当前第44页；编辑于星期三\13点3分结晶的过程1.形成过饱和溶液。2.晶核的形成。3.晶体的生长。

其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提，过饱和度是结晶的推动力。本文档共83页；当前第45页；编辑于星期三\13点3分二、结晶的过程过饱和溶液的形成（1）热饱和溶液冷却适合溶解度随着温度降低而显著减小的情况。（2）部分溶剂蒸发法蒸发法是使溶液加压、常压或减压下加热，蒸发除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。（3）化学反应结晶法通过加入反应剂或调节pH生成一个新的溶解度更低的物质，当其浓度超过它的溶解度时，就结晶析出。（4）盐析法本文档共83页；当前第46页；编辑于星期三\13点3分2.晶核的形成在工业结晶中，有3种不同的起晶方法：一种是自然起晶法，即在一定温度下使溶液进入不稳定区，形成符合要求的晶核后加入稀溶液使溶液进入亚稳定区，溶质在晶核表面长大。第二种是刺激起晶法，即将溶液蒸发进入亚稳定区后加以冷却，使之进入不稳定区后产生一定的晶核，晶核析出后会使溶液浓度降低在进入亚稳定区，在亚稳定区内使晶体生长。第三种是晶种起晶法，即将溶液蒸发或冷却至亚稳定区后投入一定数量和大小的晶种，使溶质在所加晶种表面长大。本文档共83页；当前第47页；编辑于星期三\13点3分3.晶体的生长晶体生长：在过饱和溶液中已有晶核或加入晶种后，以过饱和度为推动力，晶种或晶核将长大，这种现象称为晶体生长。影响晶体生长的主要因素有：①杂质②搅拌③温度④过饱和度本文档共83页；当前第48页；编辑于星期三\13点3分三、晶体质量控制晶体的质量主要指晶体的大小、形状和纯度三个方面。重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂溶解，再次结晶，使其纯度提高的操作。本文档共83页；当前第49页；编辑于星期三\13点3分四、结晶的应用工业结晶技术广泛应用于红霉素、四环素、制霉菌素等抗生素及谷氨酸、赖氨酸等氨基酸的纯化精制。本文档共83页；当前第50页；编辑于星期三\13点3分第五节电泳一、电泳原理与分类

将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。本文档共83页；当前第51页；编辑于星期三\13点3分电泳的类型电泳主要有区带电泳、等电点电泳和等速电泳等。本文档共83页；当前第52页；编辑于星期三\13点3分二、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，它的分子结构大部分是由1,3联接的β-吡喃半乳糖，1，4联接的3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替而成的，其结构为：

本文档共83页；当前第53页；编辑于星期三\13点3分在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。染色：本文档共83页；当前第54页；编辑于星期三\13点3分电泳仪电泳槽本文档共83页；当前第55页；编辑于星期三\13点3分琼脂糖凝胶电泳装置

本文档共83页；当前第56页；编辑于星期三\13点3分操作流程大致为：凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳→观察和拍照。本文档共83页；当前第57页；编辑于星期三\13点3分操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相本文档共83页；当前第58页；编辑于星期三\13点3分称量、加入缓冲液本文档共83页；当前第59页；编辑于星期三\13点3分溶胶本文档共83页；当前第60页；编辑于星期三\13点3分准备胶槽本文档共83页；当前第61页；编辑于星期三\13点3分凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml本文档共83页；当前第62页；编辑于星期三\13点3分铺胶本文档共83页；当前第63页；编辑于星期三\13点3分凝胶凝固后取出梳子本文档共83页；当前第64页；编辑于星期三\13点3分加缓冲液本文档共83页；当前第65页；编辑于星期三\13点3分准备样品本文档共83页；当前第66页；编辑于星期三\13点3分点样本文档共83页；当前第67页；编辑于星期三\13点3分电泳本文档共83页；当前第68页；编辑于星期三\13点3分注意观察溴酚蓝染液的迁移本文档共83页；当前第69页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第70页；编辑于星期三\13点3分紫外灯下观察电泳结果本文档共83页；当前第71页；编辑于星期三\13点3分照相本文档共83页；当前第72页；编辑于星期三\13点3分三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由N，N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。

丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢神经毒物。N，N’-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。

聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚合。

本文档共83页；当前第73页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第74页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第75页；编辑于星期三\13点3分SDS本文档共83页；当前第76页；编辑于星期三\13点3分聚丙烯酰胺凝胶制胶装置本文档共83页；当前第77页；编辑于星期三\13点3分本文档共83页；当前第78页；编辑于星期三\13点3分实验步骤一、制胶

1.配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS

有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而有不同的配制方法。（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度＜10420%～30