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实验一蛋白质含量的测定

(考马斯亮蓝法)1实验目的植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。2一、原理考马斯亮蓝G-250（CoomassitbrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在一定蛋白质浓度范围内（5～100μg/ml），蛋白质－色素复合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。3特点蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量(范围为5～100μg蛋白质）,，所以是一种比较好的蛋白质定量法。4二、材料、试剂与仪器设备：植物材料：各种植物叶片及其他器官或离体细胞培养物

实验器具：分光光度计；离心机；研钵；离心管；移液管，试管等；试剂1．考马斯亮蓝试剂：

2．蛋白质标准溶液：

3．90%乙醇；

4.磷酸（85%，W/V）。5三、实验步骤样品含量测定：（1）称取鲜样0.5g，剪碎放入研钵中加少量pH7.0缓冲液3ml研磨提取,再分别加2ml,1ml清洗研钵和研棒两次,倒入离心管中，7000rpm/min离心15分钟,把上清液倒入一刻度试管中,记录体积。6（2）用移液管（或移液器）取上清液0.1ml(若样品中的蛋白质含量低可取0.5ml加5ml考马斯亮蓝，按照0～100μg/mL的标准曲线求算蛋白质含量)，加入到10ml刻度试管中，再加入5ml考马斯亮蓝试剂，充分摇匀，5分钟后，在分光光度计595nm处比色。7四、结果计算样品蛋白质含量（µg/g鲜重）=(C×V/a)/W式中：C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（µg/mL）；V－提取液总体积（mL）；a－测定所取提取液体积（mL）；W－取样量（g）。8五、注意事项1.在配制考马斯亮蓝时很容易看到絮状物出现，应用滤纸加以过滤，以免影响测定

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