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文档简介

实验四、凝胶DNA回收1一、概论DNA经琼脂糖凝胶电泳分离后，有效地回收特定的DNA片段是进行随后DNA克隆的一个主要步骤。回收的DNA片段的质量的好坏将严重影响DNA转化的效率。目前虽然有许多方法可从凝胶中回收DNA，如透析袋电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、琼脂糖酶法及DEAE-纤维素膜法等，但普遍存在以下问题：1．大片段DNA不容易回收。2．

回收的DNA中存在酶反应抑制物3．

少量DNA片段的回收率低。2二、实验方法V-gene

琼脂糖凝胶DNA的回收试剂盒31、

试剂塑料件：DNA制备管，2ml离心管。DE-A溶液：凝胶熔化剂(含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解)。室温密闭贮存。DE-B溶液：高离液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上），室温密闭贮存。W1溶液：洗涤液。室温密闭贮存。W2溶液：脱盐液。室温密闭贮存。洗脱液：2.5mMTris.HCl,pH8.5。室温密闭贮存。42、实验步骤在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体体积(如100mg=100ul体积).根据凝胶浓度，按下表所提供的参数加DE-A溶液：凝胶浓度DE-A溶液体积

<1.0％3个凝胶体积

<1.5％4个凝胶体积

<2．0％5个凝胶体积

混合均匀后于70℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断摇晃，直至凝胶块完全熔化(约6-8min).在滤液中加0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，加入异丙醇至终浓度为20%。52、实验步骤(续）吸取步骤C中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min,弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5mlW1溶液，3600rpm离心30s，弃滤液;将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。再以同样的方法洗涤一次。将制备管置于离心管中，最高速度离心1min;将制备管置于新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。收集洗脱液，保存于-20℃，电泳检测DNA片段回收情况。

63、注意事项以下操作步骤适于从TAE或TBE琼脂糖泳胶中提取DNA。从其它缓冲液电泳胶中提取DNA时，加入DE-B溶液后．溶液的pH应调整到6．5以下(步骤C)。在步骤A中，将疑胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间(线型DNA长时间暴露在高温条件下易于水解)，从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。在步骤B中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA回收率。如采用离心法，在步骤5B中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次，可提高

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