实验大肠杆菌的培养和分离徐玉华

特点：结构都相当简单,形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物.微生物包括哪五类：病毒细菌、放线菌真菌原生动物

微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。实验1大肠杆菌的培养和分离下列有关操作不属于无菌操作的是A．若培养基中有葡萄糖，则用500g/cm2灭菌30minB．在接种微生物或外植体之前用酒精棉球拭擦双手C．在酒精灯火焰旁进行倒平板或接种操作D．将平板置于恒温培养箱中培养D用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作。·消毒定义一、消毒与灭菌的概念及两者的区别

·灭菌的定义·常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽孢、孢子）的方法1.灼烧灭菌灭菌的方法：2.高压蒸汽灭菌1kg/cm2、121℃下维持15-30min.3.G6玻璃砂漏斗过滤121G6玻璃砂漏斗1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思考1单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。☆菌落

单菌落的分离，是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一二、划线分离法和涂布分离法的优缺点划线分离法的操作不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。划线分离法操作（如右图所示）时要做到以下几点：①第一次划线及每次划线之前都需要对接种环进行________，待接种环冷却后才能伸入菌液，以免________________。②划线时最后一区不要与第一区________。③划线用力大小要适当，防止用力过大将________划破。培养基灼烧灭菌温度太高杀死菌种相交

划线分离法灼烧接种环冷却

划线（第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却

划线（第二区域）灼烧接种环冷却

划线（第三区域）灼烧接种环冷却

划线（第四区域）灼烧接种环冷却

划线（第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h划线分离法涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.涂布分离法的操作问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。细菌的革兰氏染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌1.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方2.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g蛋白胨：0.5gNacl：0.5g水:50ml称为LB培养基细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长固体培养基液体培养基半固体培养基培养基的类型：成分区别：琼脂培养基类型按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。液体培养基固体培养基凝固剂琼脂扩大培养，工业生产分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏选择培养基鉴定培养基天然培养基合成培养基试管斜面三、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入（二）倒平板灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.（四）大肠杆菌的划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法（五）大肠杆菌分离后保存1.临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2.长期保存：甘油冷冻管藏法1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?（1）胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度选修1P.24思考与练习2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成