单克隆抗体的研制与技术

单克隆抗体技术单克隆抗体的研制单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonalantibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonalantibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。杂交瘤技术杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。敌动物橡免疫主抗原羡制备冤仔制备喘单克汤隆抗哪体的折免疫模抗原需，从射纯度蹲上说笨虽不音要求汤很高风，但拔高纯折度的忠抗原狐使得面到所像需单演抗的沈机会旬增加霞，同黄时可滥以减哥轻筛粉选的物工作隆量。矮因此议，免板疫抗盾原是武越纯山越好标，应铲根据背所研惠究的体抗原锁和实咳验室菌的条睬件来域决定奶。一糟般来针说，咳抗原企的来遥源有脱限，毒或性直质不缴稳定务，提每纯时滔易变醋性，寸或其名免疫脖原性写很强培，或哥所需观单抗尿是用仁于抗捏原不辅同组炼分的序纯化农或分拦析等犹，免角疫用犹的抗县原只夏需初摸步提夏纯甚御至不甩提纯赖，但振抗原梯中混恼杂物赌很多果，特恭别是传如果呈这些惭混杂膨物的株免疫归原性屠较强僻时，对则必狂须对膝抗原获进行平纯化耽。检日测用栏抗原承可以赞是与达免疫述抗原球纯度怕相同尘，也虚可是澡不同隆的纯销度，槐这主烟要决晨定于冒所用彻筛检倍方法粉的种应类及统其特粗异性借和敏忌感性泡。询免疫篇动物初的选摸择毛根芝据所仍用的齐骨髓债瘤细湖胞可经选用陵小鼠返和大倡鼠作泉为免毙疫动坝物。绣因为俯，所谁有的川供杂冒交瘤米技术京用的跃小鼠治骨髓耕瘤细判胞系卧均来债源于磨BA灰LB炉/c萍小鼠畏，所桂有的随大鼠逝骨髓型瘤细辆胞都钥来源晶于L屯OU跟/c祥大鼠饭，所幼以一却般的汪杂交急瘤生炉产都炒是用统这两渴种纯沾系动粮物作袄为免方疫动姑物。趴但是羡，有洁时为赠了特烘殊目唯的而闪需进增行种贪间杂屡交，厨则可记免疫倡其他甲动物关。种追间杂宗交瘤季一般猫分泌按抗体夸的能躲力不饱稳定答，因现为染佛色体著容易否丢失贤。就业小鼠拍而言季，初碰次免迅疫时迹以8简-1臂2周扰龄为卷宜，钻雌性孕鼠较沸便于口操作倘。庄免疫芹程序裙的确嘴定死免椅疫是抄单抗躺制备捉过程财中的净重要绑环节晌之一制，其对目的电在于详使B选淋巴漂细胞颤在特咱异抗时原刺色激下仁分化毁、增跃殖，衰以利量于细醒胞融案合形斥成杂潮交细校胞，维并增悄加获傻得分婆泌特慢异性炭抗体虎的杂离交瘤黄的机素会。衡因此址在设果计免兆疫程方序时骨，应趣考虑印到抗楼原的脉性质此和纯尸度、游抗原孕量、唇免疫聚途径臭、免匠疫次搬数与海间隔邪时间杠、佐积剂的聚应用喜及动询物对哨该抗犬原的奖应答昆能力挖等。灰没有贷一个帅免疫完程序胶能适蜓用于苦各种插抗原涛。现爹用的幅免疫势程序恶中多俭数是浊参照帅制备矩常规期多克枯隆抗富体的跑方法联。表池6-阅1列含举了屡目前迁常用促的免脾疫程列序。捆免疫煌途径兴常用仪体内资免疫诱法包聚括皮圆下注图射、季腹腔砖或静辣脉注狸射，窜也采棵用足俘垫、柏皮内世、滴邻鼻或里点眼盖。最晌后一怪次加客强免恒疫多惹采用反腹腔蹦或静煎脉注躁射，创目前敞尤其眼推崇忘后者皆，因样为可腔使抗仁原对捕脾细喂胞作拆用更克迅速依而充督分。贪在最松后一娃次加杜强免脊疫后似第3遍天取幸脾融牢合为炸好，诞许多片实验峡室的么结果协表明运，初软次免两疫和游再次兽免疫旱应答隔反应免中，州取脾厉细胞建与骨袜髓瘤尿细胞夜融合绘，特搁异性伐杂交站瘤的源形成贺高峰冤分别瞧为第变4天严和第减22着天，泽在初离次免赞疫应皆答时举获得山的杂看交瘤画主要德分泌帖Ig甩M抗周体，飞再次揭免疫赛应答小时获举得的般杂交碍瘤主煌要分晋泌I望gG敲抗体叙。笔鼠者体晋会阳适性杂追交瘤削出现名的高圈峰与苗小鼠报血清绩抗体及的滴厦度并亩无明欲显的票平行沃关系耗，且锣多在而血清秒抗体床高峰分之前壳。因狗此，孔为达迈到最价高的它杂交骄瘤形蝶成率俗需要届有尽姑可能钉多的访浆母还细胞评，这为在最坊后一处次加搬强免侦疫后帮第3旱天取份脾进三行融曲合较辆适宜馆。已限有人摇报道申采用价脾内咐免疫婶，可甲提高街小鼠厨对抗勇原的萍免疫删反应盏性，悬且节宾省时士间，旬一般厦免疫刷3天妹后即参可融梨合。灵体内真免疫轧法适坛用于仆免疫肥原性绿强、扑来源漆充分嘉的抗豆原，沉对于绍免疫棚原性局很弱找或对玻机体吃有害围（如铸引起拢免疫甘抑制脊）的贪抗原郊就不浊适用娃了。协如果兼制备胃人单魂克隆悲抗体冬几乎炒不大揪可能靠采用瓦体内泥免疫锯法。咳因此逗，针识对这割些情且况，呢可采蝴用体务外免面疫。电所谓饥体外蛇免疫俭就是穿将脾息细胞原（或节淋巴宪结细议胞，倦或外锹周血睡淋巴虏细胞罗）取惹出体燥外，桌在一邮定条洗件下听与抗受原共玩同培曲养，益然后雁再与姐骨髓璃瘤细轨胞进次行融秒合。习其基栋本方孤法是咬取4久-8钉周龄窗BA服LB欧/c歉小鼠王的矿脾脏妻，制贺成单剃细胞犹悬液子，用寿无血膨清培体养液塌洗涤篮2-贺3次腰，然珠后悬民浮于僵含1刺0%裹小牛额血清炼的培们养液签中，标再加庆入适南量抗早原（乖可溶振性抗谜原0串.5带-5声ug仙/m毕l，增细胞承抗原讯10辫5售-1郊0持6劳个细击胞/撤ml阵）和截一定赶量的摄BA莫LB个/c们小鼠割胸腺起细胞厅培养价上清牢液；煮在3扇7疮℃镰，6怜%C瓶O进2拘浓度喉下培各养3战-5咸天，衬再分菌离脾融细胞驶与骨揪髓瘤举细胞怒融合别。撇表6槽-1荡不杜同免烘疫抗惨原的美免疫宅程序录免疫膜原特芬性和抗原露量欣接种呀次数具间隔态时间源单抗必的特诚性姻抗体姓滴度未亲和掌性蛛免疫末原性梁强（束如细疗胞、厌细菌嚼和病肢毒等形）择10月6扇-1片0询7唉个细晃胞或倦1-思10鸟ug牛2-眼4腿2-袖4周熄高仰中等顿至强肯免疫胀原性举中等由10气-1下00扔u倍g临2-榆4支2-订4周覆中等缝或高易中等充或强越免疫肠原性如弱功A.嚷20惧-4混00敢ug彼2-杨4芽随后太2-丘3室每月允2-科3月浑中等矛强牙B.齐10甜-5鸣0u梅g星其后藏20横0-粒40度0u桂g疼2毕其后析4阁每月捧每天残中等倦中等周C.雄10衬-1慨00众ug间2胀其后掘4顶其后订“蕉休息惹”蹲最后赠加强缸每月诉10悲天旅1-御2月王中等宏中等来或强雕（引插自刘政秀梵篮，1骄99顽4）鹿细胞励融合椒霜主要悔试剂惩的配醒制胀a.秒细胞使培养竖基词电杂交闪瘤技辽术中纯使用办的细提胞培丽养基淹主要盾有R缘PM于I-肢16调40侦或D卡ME渔M（桐Du睬lb菊er略co导M犁od抗if纽ie蝇d乱Ea辰gl妖es岁M辩ed失iu舟m）临两种体基础象培养碎基，盟具体非配制颈方法约按厂侮家规科定的冷程序朽，配喜好后订过滤纯除菌污（0怎.2似2u知m）获，分恼装，慢4架℃鹅保存潮。秃不完垫全R挑PM漫I-翠16窃40钉培养笔基：孟RP腰MI猫-1孙64彼0培拐养基励原液煤96留ml丝，1妈00秘×尽L.点G.甘溶液河1m趴l，辰双抗行溶液史1m翅l，旺7.暂5%朴N塔aH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