纤维素酶活力的测定

实验二十纤维素陋活力的测定一、目的学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酹活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。二、原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C酶、C酶和|?-葡萄糖昔酶三种主要组分。其中C1X1施的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素•，C酣的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，I?-葡萄糖甘能的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素前水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈•比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂.实验材料.实验材料（1）纤维素酶制剂（2）新华定量滤纸（3）脱脂棉花（4）装甲基纤维素钠（5）水杨酸苗.主要仪器500mg50mg/份450mg/份4(CMC)510mg500mg（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）恒温水浴2台（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）万分之一分析天平（7）恒温干燥箱（8）冰箱（9）试管架（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管 20mL24（12）移液管或加液器 0.5mL3；2mL7（13）容量瓶100mL6；1000mL3（14）量筒50mL2；100mLl；500mLl（15）烧杯100mL6；500mL3；1000mLl3.试剂（均为分析纯）（1）浓度为Img/mL的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105C下干燥至恒重，准确称取lOOrng于100mL小烧杯中，用少量蒸镭水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸储水定容至100mL,充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12〜15天）。3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸镭水溶解后，加入2moi/LNaOH溶液262mL,再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（CHOKNa!4HO,MW=282.22）的热4462水溶液中，再加5g结晶酚(CHOH,MW=94.U)和5g无水亚硫酸钠(NaSO,MW=126.04),6523搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中用蒸镭水定容至1000mL,充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。0.05mol/LpH4.5的柠檬酸缓冲液A液(O.lmol/L柠檬酸溶液)：准确称取CHO!HO(MW=210.14)21.014g于500mL6872大烧杯中，用少量蒸谯水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸镭水定容至1000mL,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。B液(0.1moI/L柠檬酸钠溶液)：准确称取NaCHO!2HO(MW=294.12)29.412g36572于500mL大烧杯中，用少量蒸储水溶解后，移入1000mL容量瓶中，然后用蒸锵水定容至1000mL,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。取上述A液27.12mL,B液22.88mL,充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸佣水定容至100mL,充分混匀，即为0.05mol/LpH4.5的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定滤纸能活力。0.05mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液取上述A液20.5mL,B液29.5mL,充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸储水定容至100mL,充分混匀。即为的柠檬酸缓冲液。4c冰箱中保存备用。用于测定C酶活力。0.51%拨甲基纤维素钠(CMC)溶液精确称取0.51gCMC于100mL小烧杯中，加入适量0.05mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100mL容量瓶中并用0.05mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4c冰箱中保存备用，用于测定C酶活力。0.5%水杨酸甘溶液准确称取0.5g水杨酸甘于100mL小烧杯中，用少量0.05mol/LpH4.5的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.05mol/LpH4.5的柠檬酸缓冲液定容至100mL,充分混匀。4c冰箱中保存备用，用于测定|?-葡萄糖甘酸活力。(7)纤维素酶液的配制准确称取纤维素酶制剂500mg于100mL小烧杯中，用少量蒸饰水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸储水定容至100mL,此酶液的浓度为5mg/mL,4℃冰箱中保存备用。四、操作方法和步骤葡萄糖(G)标准曲线的制作取8支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后按表1加入标准葡萄糖(G)溶液和蒸储水，配制成•系列不同浓度的侦萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸储水定容至20mL,充分混匀。在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。表I望萄魂标准或税制作X12345678葡若翰标液（mL）00.20.40.60.81.0121.4修馆次（mL）2.01.8161.41.21.00.80.6句曲翰含量（mg；00.20.40.60.81.0121.4滤纸酶活力的测定取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入0.5mL酣液和L5mLO.O5mol/LH4.5的柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入L5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5〜lOmin,再各加入滤纸条50mg（新华定量滤纸，约1cm!6cm）,50℃水浴中保温lh后取出立即向2、3、4号试管中各加入.5mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸储水定容至0mL,充分混匀.以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。. =董蕾糖含量（mg）-称液定容总体积（mL）xs.56.小一刀（g= 反应液中/液加入量（mL）x惮品重（g）x时间仆）式中:5.56为ling葡萄糖的molSo（1000/180=5.56）C酹活力的测定1将5mg/mL的原醐液稀释10〜15倍后用于测定C酶活力，以脱脂棉为底物。1取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入50mg脱脂棉，加入1.5mL0.05MH5.0的柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在45℃水浴中预热5〜lOmin,再各加入适当稀释后的陋液0.5mL,45℃水浴中保温24h。取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸储水定容至20mL,充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C酶活力（U/g）。在上述条件下反应24h,由底物生成葡萄糖所需的酶量定义为一个前活力单位（U）。.，t■>■含■（mg）x酸液定容苣体积（mL）x稀释管数x5.56*24C. 反应液中够液加入世（mL）x样品量（g）*时间（h）式中：24为酶活力定义中的24hoC酶活力的测定将5mg/mL的原酶液稀释5倍后用于测定C酶活力，以CMC为底物。取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mLO.51%CMC柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50C水浴中预热5〜再各加入稀释5倍后的酶液0.5mL,50℃水浴中保温30min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入1.5mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸储水定容至20mL,充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C能活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。._丁蕊♦含量（mg）“解液定容总体积（mL）X＞驿倍数X5,6Cx" 反应液中酹液加入量（mL）x样品童（g）x时间（h）|?-饰萄糖甘酶活力的测定取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL0.5%水杨酸甘柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50C水浴中预热5〜lOmin,再各加入酶液0.5mL,50c水浴中保温30min,取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸锵水定容至20mL,充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出I?-葡萄糖甘酶活力（U/g）。在上述条件下，每小时由底物生成mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。他/」含」（mg）X繇液定容启咏积（mL1*5.56'优估"小九',❷一反应液中醯液加入量（mL）x样品茎（g）x时间（h）玉、结舆计算1.茕蕾嘴（G）标准曲线的制作（表2）R2标准小娥测定数先列及管号 12345678便荀黝含量（mg） 0020.40.60.81.01.21.4光客文（ODyg）根据表中数值,以董萄糠（G）含量（mg）为横坐标,以对应的光年变值为纵空标.在色标纸上绘制出董状精标准由俵，并在坐标纸的右上角写上实醛题目、时间、实验人,.滋豕酪活力的测定结果计算（表3）及3法纸快活力的测定数据元及管号1234三管平均任光容度（ODnm）0锦萄翰含量（mg>0根据潴纸瓶活力公式，计算臼逋水诲活力（Ug）i谑纸够活力（fg）=就端糖含量(mg)x】oo(mL)x5.56

谑纸够活力（fg）=.C；够活力的测定结果计算（表4）及4C,总活力的洌定数据丹农管号 I 234三管平均企尤秀度任 0他电糖含量（mg） 0根据a牌活力公式,计算出c*活力（u/g）»一——（mg）xlop（mL），4莽倍数x5.56x240.5(mL)*0.5(g)«24(h)4.Cx需活力的测定结舆计算管号I 234三管平均位产容度假0能的粉含量(mg)0根据0质活力公式,计算出Q点活力(U/g),Cx的活力(U/g)=竟筱党含量(mg)x】00(mL)>5(倍)Cx的活力(U/g)=工；工董部瑞甘梆活力的测定结果计算管号I234三管平均值乃再度位0牝瞥触含量(mg>0根据区筮微野甘够活力公式，计算出a筮能摒甘酸活力(i；g)i，:镯糖甘黑活力(Lg)=黄优野