应用寡核苷酸芯片进行HLA

应用寡核苷酸芯片进行HLA【摘要】为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明：100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95%。结论：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。

【关键词】基因分型

HLA-DQA1GenotypingbyUsingOligonucleotideMicroarrays

AbstractInordertofabricatetheHLA-DQA1genotypingchipanddevelopanintegrated，paralleltechnicalplatformtotypeHLAsystem，apairofprimersandasetofprobesweredesignedaccordingtothesequencesofHLA-DQA1exon2，wherethepolymorphismisconcentrated.Theoligonucleotidechipwasmadewiththemethodsdevelopedinourlaboratory.ThetargetDNAwasasymmetricallyamplifiedwiththelabeledsenseprimer.ThesignalswerescannedandanalyzedafterthehybridizationbetweenmicroarrayandPCRproduct.Thealleletypesofthesampleswereidenlified.TheresultwasverifiedbythestandardDNAandDNAsequencing.Theresultsshowedthatthegenotypingwassuccessfullycarriedoutin50standardDNAsamplesand50clinicalsamples.Amongthem，resultsofthe50standardDNAsamplesmatchedtheirtemplates.Intheother50samples，resultsoftherandomlyselected10matchedtheirsequencingresultsexceptthattwoofthemgottheincompletelyresult.Inreproducibletests，thesignalreappearratewas95%.ItisconcludedthatHLA-DQA1genotypingbyusingourarraysystemissimpleandconvenientwithsatisfiedaccuracyandreproducibility.

KeywordsHLA-DQA1；genotype；oligonucleotidechip

组织配型的情况是影响器官移植成活率的关键因素，同时，特定的HLA基因座位还和某些疾病相关联，因此HLA的分型工作亦受到广泛重视。到目前为止，国内外的HLA的分型研究仍多集中于A、B、DR位点。近年来，组成较为复杂的Ⅱ型位点因与疾病有较多关联而多有报道。其中DQ位点与扩张性心肌症［1］，病毒性乙型肝炎［2］，糖尿病［3，4］，银屑病［5］等多种疾病的罹患率及预后相关。1996年，HLA-DQ也被定义为移植抗原［6］。

目前，HLA分型有血清学分型和基因分型，后者更具优势和发展前途。对基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOP方法，但两者在设计或操作上略显繁琐。基因芯片的问世为HLA分型工作提供了新的思路，基因芯片的高通量、集成化和并行检测等优势使其极为适用于复杂的HLA遗传系统。国内外在这方面的报道很多，但尚没有成熟的分型产品问世，也未见临床大规模应用的报道。本研究使用自行构建的寡核苷酸芯片，对HLA-DQA1位点进行基因分型检测，旨在建立一套成熟的分型技术，用于复杂的HLA系统的分型研究。

材料和方法

DNA样本

50例临床样本采自中国医科大学附属第一医院，50例标准DNA样品由中国刑警学院法医系法医学教研室提供［7］。

主要试剂及仪器

手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(Sigma公司)，PCR试剂盒及相关试剂(Promega公司)，鲑鱼精DNA，其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪，生物芯片点样仪(MGⅡ600，BioRobotics，England)，激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSIV，GenomicSolutionsInc.USA)

引物及探针

根据GenBank数据库新近公布的HLA-DQA1等位基因序列，在多态性集中的exon2保守区及变异区分别设计1对引物及16条特异性分型探针，交由上海生物工程公司合成，并在正义链引物5’端作FITC标记，序列P1(+)Exon2:5’-TGTATTACATGGGAATATGTGATTTTAGA-3’；P2(-)Exon2:5’-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3’，并在各探针5’端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。

全血基因组DNA的提取

改良的酚/氯仿法:1ml抗凝的外周血，896×g离心5分钟，分离中层白细胞后，传统酚/氯仿/异丙醇法［8］抽提DNA，-20℃保存。

PCR扩增与产物标记

扩增体系20μl，含基因组DNA1μl。以组间特异性引物，行1∶20不对称扩增。扩增条件96℃5分钟，96℃30秒，59℃40秒，72℃40秒，35个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。

载片制备

本室自建流程。市售玻片于铬酸溶液中浸泡12小时以上，蒸馏水洗净，1NNaOH浸泡1小时，丙酮化3分钟。浸入手臂分子溶液10分钟，丙酮清洗，104℃烤干后，5%戊二醛中浸泡过夜。

寡核苷酸微阵列的制备

以预先摸索好的条件，将16条寡核苷酸探针以探针缓冲液重悬至80μmol/L，与同等浓度的阳性对照探针、阴性对照无关探针、空白对照探针缓冲液，共同加入384孔板。启动生物芯片点样仪，制成预先设计好的微阵列。点样中注意保湿，点样后37℃水化过夜，80℃烤干，备用。Table.Probesequences(略)

封闭与核酸杂交

按本室方法［9］。取制备好的寡核苷酸芯片，用前以%SDS洗去多余的未共价结合的探针。浸入5﹪二乙胺，室温封闭30分钟，充分洗净吹干。PCR产物加杂交液按1∶1稀释混匀，取8μl覆盖于各微阵列，加放硅烷化盖片。置入湿度适宜的杂交舱中55℃保温30秒。

洗涤与检测分析

取出杂交芯片，冲去盖片。用预热至60℃的洗液(1×SSC/%SDS，×SSC/%SDS，×SSC)行梯度洗涤，用ddH2O洗净，吹干。使用激光共聚焦扫描仪检测，CCD成像软件分析杂交信号，确定样本的基因型。

结果

基因组DNA的获取及靶基因的扩增

基因组DNA的浓度为100-200ng/μl。A260/280值1，纯度均50﹪。PCR产物经PAGE检测，可见扩增条带清晰，特异性理想，对称产物长度538bp，与设计相符。

寡核苷酸芯片的分型

100份样品分型全部成功。其中50份标准样品分型结果与其模板全部相符。另50份临床血样随机抽取10份进行PCR产物测序，2份分型结果不完全相符(测序确定其为复合型，分别为0301/04，04/06；基因芯片分型为单纯型，即0301，04)，另8例正确。图A，B，C示1例选择测序的临床样本。

分型结果的稳定性

为验证芯片的稳定性及重现率，随机选取10份样品重复5次杂交实验。16个分型位点中，2份样品完全重复，3份可重复15个分型位点，5份重复14个分型位点。重现率95%。

讨论

HLA复合体遗传区位于，长约3600kb，约占人类基因组总长度的1/3000。第十三届国际组织相容性专题会议确定已发现的HLA等位基因达到1340个。HLA血清学分型多用微量淋巴细胞毒实验，在20世纪80年代中期之前是HLA研究的重点，其检查Ⅰ类抗原经济有效，但在检测Ⅱ类抗原时却遇到了困难：一方面Ⅱ类抗原在未激活T细胞上不表达，需分离纯化B细胞；另一方面Ⅱ类抗原多由双座位等位基因构成复杂的多态性，使得准确判定相应等位基因产物的抗原特异性十分困难。Opelz等［10］曾将来自58个移植中心的4000份冰冻组织标本进行回顾性分析，发现血清学方法分型HLA-A、HLA-B错误率4%-%，而HLA-DR分型错误率高达25%。因此Ⅱ类抗原多不采用血清学分型。目前，HLA基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOP。Bunce等［11］用188个引物，经144次PCR建立一步法PCR-SSP，成功地对HLA-Ⅰ、Ⅱ类所有抗原进行了分型。该方法特异性较高，但主要依赖于PCR技术，操作略显繁琐，且结果分析非常复杂。PCR-SSOP因具有灵敏度高、误差率小、样本量少的优点，是现今国内外分型应用最多的方法。但该法选择的支持介质是膜［12］或微滴定板［13］，对于HLA复杂的等位基因，不具有集成化的优势。基因芯片作为“20世纪影响最为深远的科学技术手段之一”，非常适合分型复杂的HLA系统，已引起众多科研机构的关注。但各家在制作分型芯片时方法差别相当大，表明基因芯片的技术流程还需要标准化。

国际上对实质性器官移植通用“六抗原无错配”标准，即HLA-A、-B、-DR在供受者中无错配，记为“0AgMM”［14］。而HLA-DQA1，-DQB1及-DRB1的连锁不平衡导致在限定人群中产生预期的抗原系。如大多白种人供受HLA-A、-B、-DRB1匹配者，HLA-DQB1及HLA-DQA1也同样匹配［15］。本研究所采用的HLA-DQA1位点的探针组合，尚属中等分辨率检测，若进行高分辨率检测，还需要设计

1LiuW，LiWM，SunNL.RelationshipbetweenHLA-DQA1polymorphismandgeneticsusceptibilitytoidiopathicdilatedcardiomyopathy.ChinMedJ，2004；117:1449-1452

2ZangGQ，XiM，FengML，etal.Curativeeffectsofinterferon-αandHLA-DRB1—DQA1and-DQB1allelesinchronicviralhepatitisB.WorldJGastroenterol，2004；10:2116-2118

3罗佐杰，粱杏欢，粱敏等.HLA-DQA1基因与广西地区壮族、汉族2型糖尿病关联性研究.中华内分泌代谢杂志，2004；20:425-427

4张冬梅，周智广，张弛等.应用HLA-DQ基因型对自身抗体阴性1型糖尿病的再分型.中华内科杂志，2004；43:174-178

5ZhengGY，WeiSC，ShiTL，etal.Associationbetweenalcohol，smokingandHLA-DQAI*0201genotypeinpsoriasis.ActaBiochimicaBiophysSin，2004；36:597-602

6PetersdorfEW，LongtonGM，AnasettiC，etal.DefinitionofHLA-DQasatransplantationantigen.ProcNatlAcadSciUSA，1996；93:15358-15363

7张璐，李树，巴华杰等.中国五个民族HLA-DQA的PCR多态性.中国刑警学院学报，2004；4:50-51

8KramvisA，BukofzerS，KewofhepatitisBvirusDNAextractionsfromserumbytheQIAampbloodkit，GeneRelea-ser，andthephenol-chloroformmethod.JClinMicrobiol，1996；34:2731-2733

9何群，赵雨杰.一种新的DNA芯片的封闭方法.遗传，2004；26:361-363

10OpelzG，MytilineosJ，SchererS，etal.SurvivalofDNAHLA-DRtypedandmatchedcadaverkidneytransplants.Lancet，1991；38(8765):461-463

11BunceM，O’NeillCM，BarnardoMC，etal.Phototyping:comprehensiveDNAtypingforHLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5andDQB1byPCRwith144primermixesutilizingsequen