浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备

浅论幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagM基因的克隆、表达及抗体制备【摘要】目的：构建表达幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,)NCTC11637IV型分泌系统cagM(HP0537)全长编码基因的原核表达载体，分析其抗原性并制备抗体。方法：应用PCR技术从基因组扩增cagM基因片段,TA克隆后测序分析，并构建表达载体pET28a(+)cagM,转化BL21，IPTG诱导表达，SDSPAGE及鉴定表达蛋白，表达蛋白以Ni2+NTA柱进行纯化，用软件分析其抗原性后，免疫家兔制备多克隆抗体，ELISA检测多克隆抗体效价。结果：测序结果表明cagM基因全长1131bp(基因库登录号为GU269568)，编码376个氨基酸，与基因库中已知菌株J99，26695和G27的氨基酸同源性为98%～99%；诱导表达后经SDSPAGE检测表明，在43700处发现一条新生条带，Ni2+NTA柱纯化后为单一条带，软件分析表明其抗原性较强，免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶×105。结论:首次成功克隆并表达了pNCTC11637cagM基因，并制备了其抗体，为以后进一步研究其生物学功能以及相关疾病的检测与治疗奠定了基础。

【关键词】幽门螺杆菌；Ⅳ型分泌系统；cagM基因；抗体

CloningandexpressioncagMgeneofHelicobacterpyloritypeⅣsecretionsystemandantibodypreparation

TIANShuwei,SHAOShihe,HANJun,HUANGHe,HUANGShiteng

(InstituteforLifeSciences;DepartmentofMicrobiology,SchoolofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China)

［Abstract］Objective:ToconstructprokaryoticexpressionvectorforexpressingcagM(HP0537)ofHelicobacterpylori()NCTC11637ofⅣtypesecretionsystem,toanalyzeitsantigenicityandtoproduceantibodies.Methods：PCRtechnologywasusedtoamplifycagMfromthegenome.ThenTAcloningwasusedforsequenceanalysis.WeconstructedexpressionvectorpET28a(+)cagM,andtransformedittoBL21.IPTGwasusedtoinduceexpression.AfterSDSPAGEforidentificationofexpressedproteinandNi2+NTAcolumnforpurification,usedsoftwareanalysisofitsantigenicity,andpreparedantibodybyimmunizationofrabbits.Atlast,ELISAwasusedtodetectpolyclonalantibodytiters.Results:cagMgenesequencingresultsshowedthatthefulllengthwas1131bp(GenBankaccessionnumber:GU269568),encoding376aminoacids.ComparedwithstrainsJ99,26695andG27,itsaminoacidhomologywas98%～99%.AftertheinducedexpressionandSDSPAGEanalysis,inthe43700positionfoundanewband,andNi2+NTAcolumnpurifiedwasasingleband.Thesoftwareanalysisshowedthattheantigenicitywasstronger.Thepreparedrabbitpolyclonalantibodytiterwas1∶×105.Conclusion:ForthefirsttimesuccessfullyclonedandexpressedtheNCTC11637cagMgenes,andprepareditsantibody,whichprovideafoundationforfurtherstudyitsbiologicalfunction,aswellasthedetectionandtreatmentofHelicobacterpylorirelateddiseasesresearchinthefuture.

［Keywords］Helicobacterpylori；Ⅳtypesecretionsystem；cagMgene；antibody

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,)是一种定植于人类胃黏膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，现已证实感染是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病因［1,2］，Ⅰ型基因组中有一个约40kb的基因片段，即cag致病岛，其编码一些毒素蛋白和一个分泌装置，即Ⅳ型分泌系统，TFSS形成一个跨膜通道，通过转运相关毒素如毒力蛋白CagA参与细胞信号调节，从而导致一系列病变，如胃炎、胃溃疡和胃癌等［3,4］。有研究发现cagM是Ⅳ型分泌系统的重要基因，对转运CagA和刺激上皮细胞产生炎症因子IL8非常重要［5,6］。但是，关于CagM在Ⅳ型分泌系统中的作用及在幽门螺杆菌致病过程中的作用尚未见报道。本文针对这一现状，首次克隆表达了NCTC11637cagM基因全序列，并用生物信息学方法分析了其抗原性，制备了其抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。

1材料和方法

材料

菌株及质粒

NCTC11637由中国疾病控制中心传染病预防研究所张建中教授馈赠，大肠埃希菌DH5α，BL21和pET28a(+)载体为江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存，pGEMT载体购自Promega公司。

试剂和仪器

哥伦比亚培养基、厌氧袋；ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶BamHⅠ，XhoⅠ及T4DNA连接酶，1kbDNA标准，DL2000DNA标准参照物、蛋白质分子量标准及IPTG；绵羊血；胶回收试剂盒；Ni2+NTA；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；引物；核酸紫外检测仪；PCR仪；电泳仪；超低温冰箱ULT7903V；超声破碎仪XL2020；酶联检测仪；凝胶成像及分析系统ChemidocXRS；蛋白垂直电泳仪，其他试剂均为普通分析纯试剂。

方法

的培养与基因组提取

将NCTC11637标准菌株接种于含10%羊血的哥伦比亚平板上，37℃，微需氧培养72h，从培养基上刮取生长状态良好的菌落，用PBS洗涤3次收集细菌。基因组提取用酚氯仿提取法，参照《分子克隆》。

cagM基因PCR扩增

根据基因库中已报道的的全基因组序列，用设计cagM引物，上游5′TAGGGATCCGAGCAGTTTGGTTCATTT3′；下游5′CGCCTCGAGCTATTCAAAGGGATTATTC3′，并在其5′端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点和保护碱基，PCR产物全长1149bp，PCR参数：94℃5min，94℃30s，56℃45s，72℃1min，30个循环，72℃10min。PCR产物经%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析，拍照，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

目的基因TA克隆和测序

胶回收的PCR产物与pGEMT载体连接后，转化DH5α。转化后的细菌涂布于含50μg/ml氨苄西林的LB平板筛选，挑菌于含氨苄西林的液体LB培养基中扩增，收集菌液，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，将鉴定正确的pGEMTcagM，送上海生工生物公司测序，将测序结果提交基因库，并获取登录号。

生物信息学软件分析CagM化学特征及抗原性

用Antheprot软件分析CagM蛋白的氨基酸组成、相对分子质量、等电点、疏水性和抗原性等。

重组表达质粒的构建和鉴定

将构建好的pGEMTcagM载体和表达载体pET28a(+)都用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物电泳后将目的片段胶回收。将切胶回收纯化的目的基因和表达载体按3∶1(摩尔数)用T4连接酶进行连接，反应体积为10μl，于16℃连接过夜。将构建的pET28a(+)cagM载体转化大肠埃希菌BL21，涂于含卡那霉素(100mg/L)的LB固体培养基的平板中，37℃生长12～16h。挑取单个菌落于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、250r/min摇过夜菌，碱裂解法提取质粒，BamHⅠ进行酶切鉴定。将鉴定连接成功的重组质粒pET28a(+)cagM载体送上海生工生物公司进行测序，以确定连接方向正确。

融合蛋白的表达纯化

挑阳性单克隆子接种于3ml的LB培养基中(含100mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。取上述培养物按1∶50体积接种于新鲜LB培养基，37℃振荡培养至D为～时，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养。收集诱导4～5h的菌液，5000r/min离心液和PBS重悬菌体，100℃煮沸5～10min，离心取上清进行10%的SDSPAGE电泳分析。蛋白Ni2+NTA柱纯化，按试剂盒的说明书操作，纯化后SDSPAGE电泳检测。

多克隆抗体制备

弗氏完全佐剂制备：取羊毛脂3g,液体石蜡3ml,卡介苗5mg；先研磨羊毛脂和液体石蜡至乳白色均匀糊状，逐滴加入卡介苗与目的蛋白混合物，继续研磨成油包水制剂。

将弗氏完全佐剂与纯化后的CagM重组蛋白按1∶1的体积比例充分研磨，制备成油包水乳化剂，吸取1ml制备好的抗原，采用每只多点免疫3次，每隔5天1次，免疫3次后用蛋白原液耳缘静脉免疫，每次约注射1ml，每隔2天1次，连续5次，末次免疫后7天心脏采血，室温放置2h后，10000×g离心10min,吸取抗血清分装贮存于-70℃。

ELISA测定多克隆抗体效价

取适量ELISA板条，加入包被液适量稀释的CagM重组蛋白(5μg/ml),100μl/孔，4℃冰箱过夜；加入洗涤液，300μl/孔，静置2min,吸出洗液弃掉，反复洗3次；加入封闭液(%牛血清白蛋白)，150μl/孔，4℃冰箱过夜后，洗3次；加入待测血清标本(倍比稀释)，同时加入阴性血清及不加血清以作为阴性对照和空白对照，100μl/孔，37℃1h，如上洗板孔3次；加入用封闭液以1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃1h，如上洗板孔3次；加入底物工作液(OPD)，现用现配，100μl/孔，置37℃暗处反应5min；每孔加入50μl终止液(2mol/L硫酸)混匀；酶标检测仪在450nm处测定每孔的光密度值，扣除空白孔值后，P/N值≥，判为阳性(P：测定孔光密度值；N：阴性对照孔光密度值)，其抗体效价为阳性结果时的最大稀释度。

2结果

目的基因PCR扩增结果和TA克隆鉴定

PCR结果显示在1149bp左右有一条带，与预计大小一致，无非特异性条带，见图1a。将PCR产物与pGEMT载体连接产物转化至DH5α，随机挑取阳性菌落，抽提质粒，双酶切产物电泳后，阳性克隆出现的两条带分别位于约3003bp和1149bp处，见图1b。

cagM基因片段的序列测定及其编码蛋白的理化特性预测

将鉴定后的重组质粒送往上海生工进行序列测定，DNA测序结果表明，构建的重组质粒上的cagM长度为1149bp，与设计序列大小完全一致，将测序结果提交基因库后，获取登录号为GU269568。基因编码376个氨基酸，其中65个碱性氨基酸，52个酸性氨基酸，126个疏水性氨基酸，111个非极性氨基酸，相对分子质量约为43700，等电点为。用Blast搜索发现cagM基因与基因库中已知菌株J99，26695和G27的同源性在96%以上，而CagM蛋白的同源性在98%以上。如图2，从疏水性曲线和亲水性曲线可以看出CagM蛋白有多个疏水区域和多个亲水性区域；从易溶性曲线明显可以看出CagM有7个易溶区，N端有4个大的区域，分别位于28-35，81-94，138-148和181-193处，C端有3个小区域位于315-355之间；图中抗原性曲线有多个峰，位置与易溶曲线吻合。

重组表达质粒的酶切鉴定

重组质粒pET28a(+)cagM经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定结果见图3。

目的蛋白在中的表达与纯化

含重组质粒的转化菌经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析，结果显示约43700处出现一条蛋白带，见图4，与理论推算目的蛋白的相对分子质量基本一致。通过优化诱导温度、诱导时间和IPTG浓度，确定最佳表达条件，大量诱导表达，用Ni2+NTA柱纯化后，SDSPAGE分析，发现纯化后蛋白条带清晰，无杂带，说明目的蛋白纯度很高，见图5。

CagM的多克隆抗体制备结果

CagM重组蛋白免疫家兔获得抗CagM多克隆抗体，以免疫前兔血清作为阴性对照，对抗体进行倍比稀释后做ELISA，每个稀释度做3个复孔，测定450nm时的光密度值，取平均值，抗体效价是可以检测为阳性结果时的最大血清稀释倍数。结果见表1，根据测定结果，抗体效价为1∶×105。表1CagM抗体效价测定结果

3讨论

幽门螺杆菌cag致病岛基因呈高密度分布并编码CagA和VacA等毒素和一个分泌转运系统(TFSS)。Tanaka等［7］认为的TFSS装置是伸出细菌外膜表面的丝状大分子结构，且目前认为，TFSS可以通过转运细胞相关毒素CagA而参与诱导上皮细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NFκB、诱导促炎细胞因子白细胞介素8的表达等，在致病中起着关键作用［8-12］，该致病岛的分割及缺失或突变可以引起致病菌株的毒力下降。因此，研究TFSS的结构和功能以及其组成蛋白的结构和功能对相关疾病的诊断和治疗具有很大意义。CagM作为TFSS的重要组成之一，在其组装和转运CagA等过程中有重要作用，但是CagM的结构和功能尚未有研究报道。

本研究针对这一现状，用PCR技术从NCTC11637菌株中克隆出cagM全长基因片段，并对其DNA序列进行测定，将测序结果提交基因库，丰富了的基因信息。序列比对是发现新基因和研究基因功能的重要手段，所以本研究用同源序列比对分析发现cagM基因与基因库中已知菌株基因的同源性均在96%以上，且CagM蛋白的同源性在98%以上。这说明cagM基因是一个很保守的基因，预示了其在的生活史中有重要功能，证明其在进化过程中发挥了重要作用。现在，生物信息学作为一门新兴的综合学科，给生物科学的发展开辟了新的领域。诺贝尔奖获得者在1991年曾经指出，一个科学家现在可以从理论推测出发，然后再回到实验中去，追踪或验证这些理论假设，这就是生物信息学的价值所在。本研究用软件分析了CagM蛋白的氨基酸组成和其他理化性质，为进一步的研究其结构和功能提供了理论依据。疏水性和亲水性分析是蛋白质分析的重要部分，CagM整个蛋白有7个易溶区域，且与亲水性区域一一对应，这提示CagM在形成高级结构时这些区域显露在外面，形成可溶性区域，其他疏水性区域则被包裹在蛋白质内部形成疏水内核。蛋白质的结构决定其功能，通过分析其抗原性看出，CagM有多个抗原决定簇，抗原性很强，其分布与易溶区域吻合，可见其在包装折叠过程中亲水区域显露在外部形成抗原决定簇，在抗原性曲线上N端有4个较强的峰，C端有几个弱的峰，这提示CagM的抗原决定簇主要集中在N端。

近年来，免疫学实验技术得到空前的发展，几乎可以应用到生物医学的各个领域，例如：免疫亲和层析、免疫印迹、免疫标记、免疫PCR、免疫细胞分离，免疫检测、免疫鉴定和免疫分离等。CagM是一个保守性和抗原性都很强的蛋白，制备其高纯度蛋白和抗体可以用于上述各领域，这对进一步研究其结构和功能以及研究致病机制、检测、相关疾病的治疗、Ⅳ型分泌系统的组装机转运机制和疫苗筛选等有很重要的意义，所以本研究用重组工程菌在IPTG诱导下表达出目的蛋白，并用Ni2+NTA柱将其纯化，获得了CagM工程蛋白，并通过免疫家兔获得CagM高效价多克隆抗体。

【参考文献】

［1］BackertS,SchwarzT,MiehlkeS,etal.FunctionalanalysisofthecagpathogenicityislandinHelicobacterpyloriisolatesfrompatientswithgastritis,pepticulcer,andgastriccancer［J］.InfectImmun,2004,72(2):1043-1056.

［2］SandersMK,PeuraDA.Helicobacterpyloriassociateddiseases［J］.CurrGastroenterolRep,2002,4(6):448-454.

［3］CuiLL，ShaoSH.ThetypeⅣsecretionsystemencodedbythecagPAIofHelicobacterpylori［J］.WeiShengWuXueBao,2007,47(4):743-745.

［4］HatakeyamaM.OncogenicmechanismofHelicobacterpylori［J］.NihonRinshoMenekiGakkaiKaishi,2008,31(3):132-140.

［5］PintoSantiniDM，SalamaNR.Cag3isanovelessentialcomponentoftheHelicobacterpyloriCagtypeⅣsecretionsystemoutermembranesubcomplex［J］.JBacteriol,2009,191(23):7343-7352.

［6］MattarR,MarquesSB,MonteiroMdoS，etal.Helicobacterpyloricagpathogenicityislandgenes:clinicalrelevanceforpepticulcerdiseasedevelopmentinBrazil［J］.JMedMicrobiol,2007,56(Pt1):9-14.

［7］TanakaJ,SuzukiT,MimuroH,etal.StructuraldefinitiononthesurfaceofHelicobacterpyloritypeⅣsecretionapparatus［J］.CellMicrobiol,2003,5(6):395-404.

［8］