动物源食品安全现状及快速检测技术研究进展概述

动物源食品安全现状及快速检测技术研究进展中国农业大学沈建忠2010年11月当前第1页\共有100页\编于星期四\20点主要内容一、畜牧水产养殖业及动物源产品简况二、动物源食品安全现状三、食品安全监控相关法律法规四、有害化合物残留检测技术五、快速检测产品研制六、展望当前第2页\共有100页\编于星期四\20点

中国是养殖业大国，其中：猪，60960万头奶牛，1300万头禽，120亿羽羊，28564.7万只一、畜牧水产养殖业及动物源产品简况当前第3页\共有100页\编于星期四\20点

中国又是动物源产品生产和消费大国，其中：肉类，7300万吨，人均达56kg；蛋类，2650万吨，人均达20kg；奶类，3650万吨，人均达28kg；水产品，4900万吨，人均达38kg。当前第4页\共有100页\编于星期四\20点二、动物源食品安全现状全球经济一体化和食品贸易国际化使食品安全成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。其中外源化合物（兽药、药物添加剂、违禁药物等）残留超过最高残留限量标准以及临床使用不遵守休药期是影响动物源食品安全的最主要因素之一。尽管世界各国采取了一系列政策和监控措施，但世界范围内涉及食品安全的恶性、突发事件时有发生，食品安全现状仍然令人担扰。我国目前食品检测数量仅占食品生产总量的1.5%，且大多数为出口食品，国内消费食品检测比率极低。当前第5页\共有100页\编于星期四\20点1、国外动物源食品安全事件

—1972年墨西哥抗氯霉素伤寒杆菌1400人死亡

—上世纪70年代意大利波多黎各玉米赤霉醇污染牛奶上千儿童性早熟

—1995年日本O157:H7

涉及44个都府县上万人中毒死亡11人

—1996年英国疯牛病损失300亿美元

—1999年比利时二恶英1000万只鸡被屠宰损失3.55亿欧元

—1999年美国法国李斯特杆菌20人死

—2000年日本大阪牛奶金黄色葡萄球菌14500人腹泻等80人住院强制召回

当前第6页\共有100页\编于星期四\20点—2001年英国口蹄疫迅速入侵欧洲大陆和南美洲—2003年欧洲甲孕酮污染猪饲料—2005年英国苏丹红事件—2006年美国毒菠菜事件大肠杆菌污染造成26个州200余人感染，其中3人死—2008年日本水银大米水银污染田种植水稻出售—2009年美国花生酱事件花生酱和花生糊被沙门氏菌污染，造成636人感染，至少9人死亡。—2009年加拿大李斯特杆菌事件1人死当前第7页\共有100页\编于星期四\20点2、国内动物源食品安全事件—1987年上海毛蚶甲肝30万市民感染—1997年香港禽流感事件—1998江西食用装过有机锡油桶中的猪油200多人中毒3人死亡—1999年8月至2000年1月化学物或微生物污染出口到美国的634批食品遭销毁—农畜产品农药残留超标2001年24个省（市）、自治区调查食品中农药残留超标率高达18.5%—2001年苏皖等省肠出血性大肠杆菌O157:H7污染食物引起2万余人中毒177人死亡当前第8页\共有100页\编于星期四\20点—2002年广西柳州市78人食用有机磷农药超标菜花中毒事件—上世纪90年代畜产品和水产品出口欧盟、日本等屡屡受阻—2002年SARS食用野生动物（动物产品）—“瘦肉精”残留事件常年发生上万人中毒—2003年广西等地猪肉氯霉素残留事件—2003年山东禽肉查出含呋吗唑酮和呋喃唑酮残留出口瑞典的遭封杀—2005年以来禽流感—2005年出口香港水产孔雀石绿当前第9页\共有100页\编于星期四\20点—2006年上海多宝鱼事件和河北红心鸭蛋事件—2007年山东多宝鱼事件—2008年出口日本禽产品硝基呋喃代谢物残留事件—2008年三鹿奶粉事件—2009年2月浙江多省63名婴儿多美滋婴儿配方奶粉肾结石—2009年4月浙江晨园乳业皮革水解蛋白—2009年12月上海熊猫乳品有限公司因三聚氰胺超标被查处—2010年1月贵州发现山东淄博绿赛尔乳业有限公司、辽宁省铁岭五洲食品有限公司和河北唐山乐亭县凯达冷冻厂生产的奶制品含有过量的三聚氰胺当前第10页\共有100页\编于星期四\20点从1997年至2007年，中国农产品外贸因食品安全绿色（技术）壁垒而受阻的产品总值超过2000亿美元；1997年香港禽流感，内地损失2亿多元，香港损失5000多万元；2002年出口欧盟水产品因氯霉素残留事件遭全面禁运造成损失6亿多美元；2004年山东出口禽肉因磺胺二甲嘧啶残留超标造成损失1.3亿元；2007年山东多宝鱼事件损失40亿元。2008年三聚氰胺损失……?当前第11页\共有100页\编于星期四\20点

细菌（如沙门氏菌、弯曲菌、李氏杆菌等）病毒（如禽流感等）寄生虫（如旋毛虫等）

化学污染

兽药残留（包括允许使用和禁用品种）农药残留（有机磷、有机氯等）环境污染物（如多氯联苯等）重金属（如铅、镉等）霉菌毒素（如玉米赤霉醇等）非法添加物（如三聚氰胺、皮革水解蛋白等）包装材料

生物污染

在养殖源头（如饲料、饲养环境）、饲养过程及产品运输、加工过程中出现：3、产生动物源食品安全问题的主要原因当前第12页\共有100页\编于星期四\20点猪及其产品残留主要品种β-兴奋剂类，如克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等镇静药物类氯霉素喹诺酮类，如恩诺沙星、环丙沙星等磺胺类，如磺胺二甲嘧啶等四环素类，如土霉素、金霉素等……当前第13页\共有100页\编于星期四\20点鸡及其产品残留主要品种硝基呋喃类，如呋喃唑酮、呋喃它酮等氯霉素喹诺酮类，如恩诺沙星、环丙沙星等磺胺类，如磺胺二甲嘧啶等四环素类，如土霉素、金霉素等激素类?……当前第14页\共有100页\编于星期四\20点肉牛及其产品残留主要品种β-兴奋剂类，如克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等玉米赤霉醇类喹诺酮类，如恩诺沙星、环丙沙星等……当前第15页\共有100页\编于星期四\20点奶牛及奶制品残留主要品种三聚氰胺、β-内酰胺酶霉菌毒素β-内酰胺类（青霉素类和头孢类），如青霉素、阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、头孢喹肟、头孢噻呋等β-兴奋剂类，如克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等喹诺酮类，如恩诺沙星、环丙沙星等氨基糖苷类，如链霉素、庆大霉素等磺胺类，如磺胺二甲嘧啶等四环素类，如四环素、土霉素、金霉素等氯霉素激素类?……当前第16页\共有100页\编于星期四\20点4、残留危害对人类健康的直接危害中毒、过敏、激素样作用、肠道菌群紊乱等对人类健康的间接危害动物源耐药病原菌沿食物链的传递、扩散对动物疾病防治的影响动物病原菌耐药性上升对环境的影响土壤中的蠕虫、微生物；水环境中的藻类、微生物当前第17页\共有100页\编于星期四\20点三、食品安全监控相关法律法规《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》《官方取样程序》《兽药管理条例》《饲料和饲料添加剂管理条例》《动物源食品中兽药最高残留限量》《饲料药物添加剂使用规范》《食品动物中禁止使用的化合物清单》

中国从1999年开始残留监控工作，先后发布以下法律法规：《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》《国家兽药残留基准实验室药物残留检测范围》《兽药停药期规定》《中华人民共和国兽药典》《中华人民共和国农产品质量安全法》《中华人民共和国食品安全法》当前第18页\共有100页\编于星期四\20点农业部235号公告中颁布了109种兽药的限量标准，涉及马、牛、羊、猪、禽、蜜蜂、鱼、虾等动物。样品有组织（肌肉、肝脏、肾脏、脂肪等）、牛奶、蜂蜜等。农业部193号公告颁布了21种食品动物禁用的兽药及其它化合物清单。当前第19页\共有100页\编于星期四\20点药物名称中国ppm美国ppm日本ppm欧盟ppm澳大利亚ppm新西兰ppm食品法典委员会ppm加拿大ppm氰甲头孢菌素///0.125////头孢氨苄0.1/0.10.1////头孢吡啉//0.030.06////头孢呋肟////0.1///头孢呱酮//0.050.05////头孢喹啉0.02//0.02/0.03//头孢喹咪//0.02/////头孢洛啉////0.02///牛奶及奶制品中兽药残留限量当前第20页\共有100页\编于星期四\20点药物名称中国ppm美国ppm日本ppm欧盟ppm澳大利亚ppm新西兰ppm食品法典委员会ppm加拿大ppm头孢洛宁//0.010.02////头孢匹林/0.02//0.010.01/0.02头孢噻呋0.10.1/0.10.10.10.10.1头孢唑啉///0.05////双氢链霉素0.2//0.20.2///双氢链霉素/链霉素//0.2//0.20.2/卡那霉素//0.40.1////庆大霉素0.2/0.20.1//0.2/新霉素0.50.150.5/0.50.51.5/链霉素0.2//0.2////当前第21页\共有100页\编于星期四\20点药物名称中国ppm美国ppm日本ppm欧盟ppm澳大利亚ppm新西兰ppm食品法典委员会ppm加拿大ppm达氟沙星0.03/0.050.03////恩诺沙星0.1/0.050.1////氟甲喹//0.1/////麻保沙星//0.0750.075/0.075//阿莫西林//0.008/////阿扑西林//0.05/////氨苄青霉素0.010.010.020.0040.01///苯唑青霉素0.03/0.030.03////苄青霉素0.004/0.0040.004//0.004/当前第22页\共有100页\编于星期四\20点药物名称中国ppm美国ppm日本ppm欧盟ppm澳大利亚ppm新西兰ppm食品法典委员会ppm加拿大ppm邻氯青霉素0.030.010.020.030.01///美西林//0.05/////奈夫西林//0.005/////普鲁卡因青霉素0.004///0.002///青霉素////0.0015//0.01I.U./ml双氯青霉素//0.010.3////四环素0.1///0.10.1//阿维菌素////0.02///伊维菌素0.01/0.01/0.050.010.01/莫能菌素//0.01/0.01///当前第23页\共有100页\编于星期四\20点药物名称中国ppm美国ppm日本ppm欧盟ppm澳大利亚ppm新西兰ppm食品法典委员会ppm加拿大ppm磺胺类0.1/0.010.1////磺胺吡啶//0.01/////磺胺二甲嘧啶0.025/0.025///0.0250.01磺胺胍//0.01/////磺胺间二甲氧嘧啶/0.010.02////0.01磺胺喹噁啉//0.01/////磺胺嘧啶//0.07/0.1///磺胺噻唑//0.09/////磺胺溴甲嘧啶钠//0.01/////磺胺乙氧哒嗪/不得检出//////磺胺乙氧嗪//0.01/////乙酰磺胺//0.01/////周效磺胺//0.06/0.1///当前第24页\共有100页\编于星期四\20点农业部193号《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》序号兽药及其它化合物名称禁止用途禁用动物1β-兴奋剂类：克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯及制剂所有用途所有食品动物2性激素类：己烯雌酚及其盐、酯及制剂所有用途所有食品动物3具有雌激素样作用的物质：玉米赤霉醇、去甲雄三烯醇酮、醋酸甲孕酮及制剂所有用途所有食品动物4氯霉素、及其盐、酯（包括：琥珀氯霉素）及其制剂所有用途所有食品动物5氨苯砜及制剂所有用途所有食品动物6硝基呋喃类：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃苯烯酸钠及制剂所有用途所有食品动物7硝基化合物：硝基酚钠、硝呋烯腙及制剂所有用途所有食品动物8催眠、镇静类：安眠酮及制剂所有用途所有食品动物9林丹（丙体六六六）杀虫剂所有食品动物10毒杀芬（氯化烯）杀虫剂、清塘剂所有食品动物当前第25页\共有100页\编于星期四\20点序号兽药及其它化合物名称禁止用途禁用动物11呋喃丹（克百威）杀虫剂所有食品动物12杀虫脒（克死螨）杀虫剂所有食品动物13双甲脒杀虫剂水生食品动物14酒石酸锑钾杀虫剂所有食品动物15锥虫胂胺杀虫剂所有食品动物16孔雀石绿抗菌剂、杀虫剂所有食品动物17五氯酚酸钠杀螺剂所有食品动物18各种汞制剂包括：氯化亚汞（甘汞）、硝酸亚汞、醋酸汞、吡啶基醋酸汞杀虫剂所有食品动物19性激素类：甲基睾丸酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇及其盐、酯及制剂促生长所有食品动物20催眠、镇静类：氯丙嗪、地西泮、及其盐、酯及制剂促生长所有食品动物21硝基咪唑类：甲硝唑、地美硝唑及其盐、酯及制剂促生长所有食品动物当前第26页\共有100页\编于星期四\20点

已发布兽药残留检测方法标准超过1000个，从2001年开始实施兽药残留监控计划，各省（市）也相应制定并实施地方残留监控计划。以2009年度农业部动物性产品中兽药残留监控计划为例，抽检动物包括牛、猪、羊、鸡、水产和蜂，抽检产品有牛奶、肉、肝、蜂蜜等，其他还有尿样。当前第27页\共有100页\编于星期四\20点

已发布兽药残留检测方法标准超过1000个，从2001年开始实施兽药残留监控计划，各省（市）也相应制定并实施地方残留监控计划。以2009年度农业部动物性产品中兽药残留监控计划为例，抽检动物包括牛、猪、羊、鸡、水产和蜂，抽检产品有牛奶、肉、肝、蜂蜜等，其他还有尿样。当前第28页\共有100页\编于星期四\20点1、鸡组织中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数氟喹诺酮类鸡/蛋辽宁等8个省250鸡/肝225磺胺类鸡/肝广西等10个省355鸡/肉387四环素类鸡/肉安徽等5个省350泰乐菌素鸡/肉河北等3个省200氯羟吡啶鸡/肉江苏等2个省200氯霉素鸡/肝北京等10个省750鸡/肉山东等7个省500地美硝唑/甲硝唑鸡/肝辽宁等6个省430硝基呋喃类代谢物鸡/肉上海等9个省550小计4197当前第29页\共有100页\编于星期四\20点2、牛奶中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数氨基糖苷类牛/牛奶上海等5个省250青霉素类牛/牛奶内蒙古等9个省500磺胺类牛/牛奶北京等5个省280四环素类牛/牛奶北京50链霉素牛/牛奶河北等5个省300氯霉素牛/牛奶黑龙江等3个省155小计1535当前第30页\共有100页\编于星期四\20点3、羊组织中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数磺胺类羊/肉新疆200氯霉素羊/肉内蒙古50小计250当前第31页\共有100页\编于星期四\20点4、猪组织中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数磺胺类猪/肉四川等13个省1062四环素类猪/肉甘肃等4个省200氟喹诺酮类猪/肉广东等6个省350喹乙醇残留标示物猪/肉吉林等5个省350克伦特罗猪/肝北京等6个省350猪/尿湖南等7个省550卡巴氧残留标示物猪/肝黑龙江等5个省500硝基呋喃类代谢物猪/肉浙江等5个省240地美硝唑/甲硝唑猪/肉重庆等6个省500小计4102当前第32页\共有100页\编于星期四\20点5、蜂蜜中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数四环素类蜂/蜂蜜浙江等55氟喹诺酮类蜂/蜂蜜北京等35磺胺类蜂/蜂蜜四川等40氯霉素蜂/蜂蜜辽宁等80硝基咪唑类蜂/蜂蜜湖北等40小计250当前第33页\共有100页\编于星期四\20点6、水产品中兽药残留监控计划化合物动物/组织样品来源检样数氯霉素斑点叉尾蛔/肉江西等129草鱼/肉416大黄鱼/肉42淡水小龙虾/肉88对虾/肉268鲫鱼/肉304鲤鱼/肉360其他322小计1929当前第34页\共有100页\编于星期四\20点化合物动物/组织样品来源检样数孔雀石绿斑点叉尾蛔/肉江苏等179草鱼/肉416鲫鱼/肉264鲤鱼/肉400甲鱼/肉96罗非鱼/肉175鳗鲡/肉114其他510小计2154当前第35页\共有100页\编于星期四\20点化合物动物/组织样品来源检样数己烯雌酚对虾/肉江苏等422淡水小龙虾/肉44硝基呋喃代谢物斑点叉尾蛔/肉湖北等71草鱼/肉133对虾/肉86河蟹/肉51鲫鱼/肉85甲鱼/肉31鲤鱼/肉103罗非鱼/肉66其他178当前第36页\共有100页\编于星期四\20点化合物动物/组织样品来源检样数喹乙醇草鱼/肉北京等416五氯酚纳河蟹/肉辽宁等240甲基睾酮罗非鱼/肉河北等175鳗鲡/肉114当前第37页\共有100页\编于星期四\20点化学物及代谢物分离纯化监控兽药等化学物样品检测方法快速检测方法仪器确证方法固相萃取技术基质固相分散技术免疫亲和色谱技术分子印迹技术超临界萃取技术四、有害化合物残留检测技术当前第38页\共有100页\编于星期四\20点微生物抑制测定法酶联免疫吸附测定法量子点标记荧光检测法荧光偏振免疫检测法化学发光免疫检测法放射免疫测定法金标试纸条生物传感器生物芯片1、快速检测方法当前第39页\共有100页\编于星期四\20点荧光偏振免疫分析技术荧光偏振免疫分析（Fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）是竞争性的均相免疫分析方法，就是检测荧光标记抗原（tracer）在结合特异性的抗体前后，荧光偏振值（FP）值的变化，不需要分离结合的和未结合的抗体，经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量，很快得到被测药物的浓度，实验的时间仅仅决定于加样的时间当前第40页\共有100页\编于星期四\20点FPIA

是竞争性的均相免疫分析抗原浓度低

FP值高AgAgAgAbAbAgAgAgAbAbAgAgPAgFAgFAgFAgF抗原浓度高

FP值小AgAbAbAgAbAgFAgFAbAgFAgFP当前第41页\共有100页\编于星期四\20点荧光素与磺胺二甲基嘧啶偶联SM2-FITCTLC分离纯化当前第42页\共有100页\编于星期四\20点FFFFFYYYYYYYFFYFYFFY测定荧光偏振值当前第43页\共有100页\编于星期四\20点

药物最低检测限ng/mL半数抑制量ng/mL回收率（%）磺胺二甲基嘧啶116鸡肉：78-89磺胺氯吡嗪0.2529牛奶：60-120磺胺甲氧吡嗪0.711.5牛奶：68-145马杜霉素2160鸡肉：92-132鸡脂肪：92-121鸡蛋：125-82盐霉素0.0833.2-喹诺酮类（12种）0.1-110-20牛奶：70-110几种兽药检测分析结果当前第44页\共有100页\编于星期四\20点FluorescencePolarizationImmunoassayforSalinomycinBasedonMonoclonalAntibody，ScienceChina:Chemistry，2010，53，553-555Determinationofveterinarydrugmaduramicininfoodbyfluorescencepolarizationimmunoassay,InternationalJournalofFoodScienceandTechnology.2008，43,114-122.Simultaneousdeterminationofsulphamerazine,sulphamethazineandsulphadiazineinhoneyandchickenmusclebyfluorescencepolarisationimmunoassaybasedonmonoclonalantibody.2008,

FoodAdditivesandContaminants,25(5):574-582.

MonoclonalAntibody-BasedFluorescencePolarizationimmunoassayfortheveterinarydrugSulfamethoxypyridazineandSulfachloropyridazineinMilk,JournalofAgricultureandFoodChemistry,2007，55(17):6871-6878.Fluorescencepolarisationimmunoassaybasedonamonoclonalantibodyforthedetectionofsulfamethazineinchickenmuscle,InternationalJournalofFoodScienceandTechnology，2007，42,36-44荧光偏振免疫分析检测磺胺二甲基嘧啶残留研究,分析化学.2007，35(6):819–824发表文章当前第45页\共有100页\编于星期四\20点时间分辩免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）是利用镧系络合物作为标记物的免疫分析技术，其络合物具有荧光寿命长、激发光谱带较宽、发射光谱带甚窄和Stokes位移大等特点，可以消除背景荧光的干扰，有效提高检测方法的灵敏度当前第46页\共有100页\编于星期四\20点双抗夹心TR-FIA反应原理示意图氯霉素莱克多巴胺当前第47页\共有100页\编于星期四\20点发表文章Amonoclonalantibody-basedtime-resolvedfluoroimmunoassayforchloramphenicolinshrimpandchickenmuscle,AnalyticaChimicaActa,2006,

575(2):262-6Time-resolvedFluoroimmunoassayforRactopamineinSwineTissue，JournalofAgricultureFoodandChemistry.2007,387,1561-1564当前第48页\共有100页\编于星期四\20点化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析（CLIA），一般分为两种模式。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量当前第49页\共有100页\编于星期四\20点Cl-ELISA与传统ELISA灵敏度比较Cl-ELISAELISADevelopmentofaChemiluminescentELISAforDeterminingChloramphenicolinChickenMuscle，JournalofAgricultureFoodandChemistry,2006,54(16),5718–5722化学发光免疫检测氯霉素当前第50页\共有100页\编于星期四\20点

量子点标记免疫分析技术

量子点(quantumdots，QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种由II-VI族或Ⅲ-V族元素组成的，直径约为1-100nm，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，量子点表面结构经过修饰，借助于其外端的羧基，能与生物分子的氨基相结合，如抗体等偶联当前第51页\共有100页\编于星期四\20点发表文章1.Simultaneousdetectionofmultiplechemicalresiduesinmilkusingbroad-specificityantibodiesinahybridimmunosorbentassay，Biosens.Bioelectron，2010，

aheadofprint2.Characterizationandapplicationofquantumdotnanocrystalmonoclonalantibodyconjugatesforthedeterminationofsulfamethazineinmilkbyfluoroimmunoassay.2007.AnalBioanalChem.389,2243-2250.3.Theapplicationofquantumdotantibodyconjugatesfordetectionofsulfamethaz-ineresidueinchickenmuscletissue.2006.JAgrFoodChem.54(17),6139-6142.4.量子点的应用---种新型的荧光定量检测技术.中国兽医杂志,2007,43(6):69~70.当前第52页\共有100页\编于星期四\20点2、仪器分析方法气相色谱法（GC）高效液相色谱法（HPLC）原子荧光法(AF)原子吸收法(AA)气谱-质谱法（GC-MS）气谱-串联质谱法（GC-MS/MS）液谱-质谱法（LC-MS）液谱-串联质谱法（LC-MS/MS）当前第53页\共有100页\编于星期四\20点1pg/g1ng/g1g/g1mg/g紫外/可见分光光度法放射免疫测定法/酶免疫测定法色质联用分析放射受体分析气相色谱(ECD/NPD)气相色谱(FID)高效液相色谱(FLD/UVD)极谱法荧光分光光度法微生物测定法比色法各种测定方法的灵敏度范围当前第54页\共有100页\编于星期四\20点有害化合物残留检测：先用快速检测产品进行筛查，可疑阳性样品再用仪器分析方法尤其是色质联用检测方法加以确证。美国、欧盟、日本等均采用此策略，抽检数量超过总样品数的10%！当前第55页\共有100页\编于星期四\20点1、快速检测产品种类试剂盒试纸条生物传感器免疫芯片快速检测仪检测箱目前主要的快速检测产品包括:五、快速检测产品研制当前第56页\共有100页\编于星期四\20点2、小分子抗体制备技术目前抗体种类主要是多抗和单抗替代抗体：基因重组抗体、纳米抗体、核酸适配体、抗转运蛋白、受体、分子印迹聚合物等均有相关研究核酸适配体抗转运蛋白当前第57页\共有100页\编于星期四\20点当前第58页\共有100页\编于星期四\20点

兽药分子量大都小于1000，药物本身没有免疫原性，必须经过结构改造后与大分子载体蛋白结合才能产生有效抗体半抗原当前第59页\共有100页\编于星期四\20点信息含量丰富的半抗原合理设计小分子结构优化计算化学性质参数（物化、电量、空间等信息）最佳半抗原免疫动物抗体合适抗原表位间隔臂最佳半抗原统计分析当前第60页\共有100页\编于星期四\20点应用量子力学AM1，得到了磺胺类和玉米赤霉醇类药物的物化、电性、疏水性等性质，从分子水平比较各药物与半抗原的异同（化学学报，2008，66，2613-2619）。为半抗原合理设计提供了方法指导SM2化学结构SM2最低能量构象SM2最高占据轨道（HOMO）和最低未占据轨道（LUMO）当前第61页\共有100页\编于星期四\20点玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布当前第62页\共有100页\编于星期四\20点Table2.Physicalandchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensVSRLogPPμHMWD18-14D18-16α-zearalanol937.37601.8590.381.1634.312.949952.51322.4011.189.37β-zearalanol925.51597.5790.381.1634.310.992254.12322.409.567.99α-zearalenol903.64583.5491.500.9034.123.203352.68320.397.996.47β-zearalenol916.33644.5591.500.9034.124.20850.39320.399.357.21zearalanone909.49593.3189.351.3733.763.4748113.07320.3910.059.33zearalenone905.71603.7490.471.1033.575.6308111.13318.378.106.44Table3.Quantumchemicalindexesofα-zearalanolandanalogsHaptensQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17EHOMOELUMO△Eα-zearalanol-0.4326-0.4929-0.6257-0.6153-0.6187-0.2388-0.3347-0.4067-12.297-1.70610.591β-zearalanol-0.4346-0.4910-0.6262-0.6155-0.6129-0.2374-0.3352-0.4071-11.988-0.88711.101α-zearalenol-0.4753-0.4830-0.6256-0.6132-0.6588-0.0885-0.1590-0.3931-12.252-2.3889.864β-zearalenol-0.4275-0.4938-0.6267-0.6147-0.6223-0.0709-0.1646-0.4037-12.190-2.14810.042zearalanone-0.4088-0.5095-0.6254-0.6117-0.4218-0.2544-0.3338-0.4040-11.722-1.8089.914zearalenone-0.4201-0.5000-0.6295-0.6155-0.4277-0.0919-0.1465-0.4120-11.882-2.5399.343玉米赤霉醇类药物的结构信息Table4.PearsonCorrelationanalysisformoleculardescriptorsandantibodyrecognitionabilityVHLogPRMWSμ△EQO1QO3QO14QO16QO18QC11QC12QC17D18-14D18-16PersonCorrelation-0.002-0.35-0.540.54-0.100.880.25-0.070.120.07-0.06-0.12-0.280.510.400.05-.001-0.22Sig.(2-tailed)0.9970.490.260.260.840.010.630.880.820.890.900.810.580.290.420.910.980.67ZHWang，JZShen.2009.JournalofMolecularRecognition,submitted.疏水性体积偶极距分子距离电量相关系数获得的分子结构信息，已用于半抗原的合理设计当前第63页\共有100页\编于星期四\20点单克隆抗体制备过程当前第64页\共有100页\编于星期四\20点脾细胞杂交瘤细胞基因重组抗体制备当前第65页\共有100页\编于星期四\20点噬菌体展示抗体库淘选策略scFv当前第66页\共有100页\编于星期四\20点双特异性单链抗体制备策略ScFv1LinkerScFv2BispesificscFvBroad-specificityantibodypCANTAB5E-bispesificscFv磺胺类喹诺酮类识别磺胺类和喹诺酮类当前第67页\共有100页\编于星期四\20点抗体评价及指导抗体定向改造CoMFA初步测定抗体特性3D-QSAR重组抗体Docking获取兽药-抗体互作主要力场预测抗体三维结构互作模型重组抗体定向改造同源模拟获取兽药-抗体互作结构信息推测兽药-抗体间发生作用的氨基酸性质推测兽药-抗体间发生作用的氨基酸位点ELISA当前第68页\共有100页\编于星期四\20点受体抗体（Acceptor）UniSenesor公司研发了基于受体的可同时检测13种青霉素和四环素两类药物的试纸条产品中国农大和北京维德维康公司合作研发可同时检测15种青霉素和头孢类药物的试纸条产品受体作为特异性识别的生物大分子，因其分离纯化及体外构建均较复杂，应用于免疫分析的报道很少TwinSensorBT当前第69页\共有100页\编于星期四\20点放射性受体分析法1978年美国波士顿大学教授Charm发明受体分析法 CHARMI是专用于牛奶中β一内酰胺抗生素残留检测方法，也是美国AOAC承认的第一个快速测定法，这个方法非常快速和灵敏，一个奶牛样品分析只需15分钟时间目前，CHARM被多国政府的农业部和卫生部采用作为的标准方法如我国:四环素类（SN/T2309-2009），β-内酰胺类(GB/T21174-2007)，磺胺类(GB/T21173-2007)

细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白质当前第70页\共有100页\编于星期四\20点微孔板检测系统基于膜的检测系统表面等离子共振传感器侧流层析技术免疫渗滤技术荧光分析系统CHARM原理当前第71页\共有100页\编于星期四\20点受体分析法的优势：可以检测同一类抗生素难点：受体的制备检测方法的应用目的基因的调取目的蛋白活性鉴定目的蛋白的表达及纯化表达载体的构建基于受体的快速检测方法建立检测方法的优化

青霉素等β-内酰胺类抗生素通过与细菌膜蛋白结合，抑制细菌细胞壁的生物合成，引起细菌细胞死亡从而发挥杀菌作用的。这种细菌蛋白被命名为青霉素结合蛋白(Penicillin-BindingProtein，PBP)2001年发现了肺炎链球菌野生R6株5个编码明确的青霉素结合蛋白的基因，其中PBP2x对青霉素类和头孢类抗生素都具有很高的敏感性当前第72页\共有100页\编于星期四\20点青霉素结合蛋白识别β-内酰胺药物列表当前第73页\共有100页\编于星期四\20点当前第74页\共有100页\编于星期四\20点基本原理目前常用的主要为ELISA试剂盒。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

（1）试剂盒3、试剂盒、试纸条研制当前第75页\共有100页\编于星期四\20点1、加入待测物；2、加入抗体；3、加入酶标二体；4、加入底物；5、加入终止液目前试剂盒最常用方法为间接竞争ELISA法，其他还用直接法、夹心法等。当前第76页\共有100页\编于星期四\20点优点

灵敏度高，特异性强，可进行定性和定量测定检测方便、快捷，一般1-2个小时就能出结果对操作者和实验室条件要求不高可以用于大量样本的快速筛选当前第77页\共有100页\编于星期四\20点试剂盒组成

96孔酶标版样品稀释液标准溶液底物溶液终止液酶标二抗工作液浓缩洗涤液抗体工作液当前第78页\共有100页\编于星期四\20点试剂盒检测需要的仪器恒温摇床离心机恒温培养箱涡动仪酶标分析仪移液枪当前第79页\共有100页\编于星期四\20点试剂盒检测所需试剂主要用于复杂样品（如肌肉、肝脏等）的前处理。大多为常规有机或无机溶剂，1、甲醇2、乙腈3、乙酸乙酯4、磷酸盐缓冲溶液5、……当前第80页\共有100页\编于星期四\20点YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP1YP2YP3YP4YP5YP6YP7YP8YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP9YP10YP11YP12YP13YP14YP15YP16YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP17YP18YP19YP20YP21YP22YP23YP24YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP25YP26YP27YP28YP29YP30YP31YP32YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40YP33YP34YP35YP36YP37YP38YP39YP40BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6阳性阴性BZ1BZ2BZ3BZ4BZ5BZ6阳性阴性ABCDEFGH123456789101112由低到高的标准溶液，用于绘制标准曲线阳性添加样品孔阴性添加样品孔实测样品区，最多可检测40个样品酶标板实际检测布局当前第81页\共有100页\编于星期四\20点试剂盒一般操作步骤1、向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液，再加入一抗，用盖板膜封板，37℃恒温箱中孵育；2、倒出孔中液体，加入浓缩洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作，用吸水纸拍干；3、加入酶标二抗，37℃恒温箱中孵育；4、倒出孔中液体，重复洗涤步骤；5、加入底物显色液A液，底物显色液B液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；6、加入终止液，轻轻振荡混匀；7、用酶标仪，测定每孔吸光度值。当前第82页\共有100页\编于星期四\20点结果判定标准曲线法：所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值（%）＝B/B0×100%B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值当前第83页\共有100页\编于星期四\20点以检测标准浓度(µg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度(µg/kg)可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。0102030405060708090100103090270810待测物浓度（ppb）吸光度（%）1当前第84页\共有100页\编于星期四\20点试纸条结构基本原理

采用竞争法，样品滴入后，在层析作用下经胶体金标记抗体的结