农学第11章 核酸合成

第11章核酸的生物合成第一节DNA的生物合成第二节RNA的生物合成6/13/20231主要内容：DNA复制：DNA复制的半保存方式；DNA复制的起始点和方向；DNA复制的酶类和蛋白质；DNA复制的根本过程；DNA的修复：DNA的损伤修复，突变；RNA的生物合成：不对称转录；RNA聚合酶；转录过程；转录后加工过程；RNA复制和逆转录：RNA复制；逆转录；重点：1.DNA复制；2.转录；难点：DNA复制和转录过程。6/13/20232DNA是生物遗传的主要物质根底，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序(三联体密码)，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。DNA是生物遗传的物质根底——遗传信息的载体6/13/20233中心法那么1964-1970劳氏肉瘤病毒的遗传方式致癌RNA病毒、植物RNA病毒病毒（复制）复制转录DNARNA蛋白质翻译逆转录1958年，遗传信息的单向遗传信息的传递6/13/20234

复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原那么将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。Reversetranscription6/13/20235第一节DNA的生物合成

DNA的复制〔DNA指导下的DNA合成〕逆转录〔RNA指导下的DNA的合成〕DNA突变DNA的损伤与修复(修复合成)6/13/20236DNA的存在形式染色体与质粒严紧控制质粒单拷贝质粒：每个细胞内只有一个或少数几个拷贝松弛控制质粒多拷贝质粒：每个细胞内含有许多拷贝〔20以上〕1DNA的复制6/13/20237病毒与细菌的DNA6/13/20238真核细胞的染色体6/13/202391.1DNA的半保存复制(一)定义和实验证据：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链那么是新合成的，这种复制方式叫半保存复制。半保存复制的实验证据:1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保存复制。6/13/202310细胞在15N标记培养基中〔NH4Cl〕连续培养15代，使所有DNA分子均标记上15N，转入14N标记的培养基CsCl密度梯度离心浮力密度

15N－DNA1.742g/ml14N－DNA

1.710g/ml15N/14NDNA1.717g/ml6/13/202311原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´DNA连接酶复习6/13/202312DNA的半保存复制的生物学意义：DNA的半保存复制说明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。

DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质:在细胞内外各种物化因子均可导致DNA损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA会发生损耗，必须进行更新；在发育和进化过程中DNA可能进行修饰、删除、扩增和重排；在进化的角度上，DNA更是处在不断的变异和开展中。6/13/2023131.2复制起点、方向和方式复制起点〔origin，ori或o，复制原点〕原核生物染色体DNA〔或真核生物的细胞器DNA〕——单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位。真核生物染色体DNA:多复制起点——一个genome中有多个复制单位复制起点：复制开始处DNA分子的特定位置复制子(Replicon)〔复制单位〕：从一个起点到一个终点所包含的DNA区域，是基因组独立进行复制的单位。许多生物的复制起点都是富含A、T的区段6/13/202314复制叉〔Replicationfork〕：DNA复制进行时，在眼的两侧出现两个叉子状的生长点(growthpoint)，叫复制叉。在复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白因子，它们构成的复合物称为复制体〔replisome〕大多数复制是双向的，形成两个复制叉；复制眼〔replicationeye〕：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛1.2.2复制方向及方式6/13/202315复制方式双向复制(bi-directional)

：大多数复制从起点开始向2个方向复制2个复制叉(replicationfork)单向复制(unidirectional)

：少数复制从起点向1个方向复制1个复制叉或生长点(growingpoint)6/13/202316真核染色体DNA线环状双链E.coli染色体DNA环状双链6/13/2023171.3与DNA复制有关的酶和蛋白质1.3.1DNA聚合酶拓扑异构酶1.3.3DNA解旋酶单链结合蛋白引发酶及引发体1.3.6DNA连接酶目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制6/13/202318DNA聚合酶(DNApolymerase):延长子链DNA聚合酶不能从头合成子链，只能延长DNA聚合酶：多种类、多种活性6/13/2023196/13/2023201〕DNA聚合反响条件〔1〕底物dNTP〔dATP，dGTP，dCTP，dTTP〕〔2〕聚合酶〔3〕模板单链的DNA母链〔4〕引物寡核苷酸引物〔RNA)〔5〕其他：解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶6/13/2023212〕聚合机制〔1〕DNA聚合酶：5′→3′的聚合活性需引物链6/13/202322〔2〕DNA聚合酶：核酸外切酶活性①3′→5′外切酶活性②5′→3′外切酶活性6/13/202323在大肠杆菌中发现主要有三种DNA聚合酶，分别为：

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

E.coliDNA聚合酶DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。6/13/202324原核生物中的DNA聚合酶在大肠杆菌中发现有三种DNA聚合酶〔用突变株研究其功能〕：⑴DNA聚合酶Ⅰ:单体酶,多肽链内含一个锌原子〔其鳌合剂是O-二氮杂菲〕，多功能酶。它具有53聚合酶功能〔对脱氧核苷酸的选择〕；35外切酶活性〔对双链无作用，校对功能。但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链〕及53外切酶活性〔双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补〕；在DNA链的3形成焦磷酸解〔生理意义不大〕；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。⑵DNA聚合酶Ⅱ：多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有35外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。

6/13/202325⑶DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。具有53DNA聚合酶活性〔亚基，速率高〕；具有35外切酶〔亚基〕的校对功能，提高DNA复制的保真性；还具有53外切酶活性〔单链有效，其意义未知〕。〔4〕DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。6/13/202326DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ亚基数目1〔单体酶〕多亚基酶多亚基酶5′→3′聚合活性+中+很低+很高3′→5′外切活性+++5′→3′外切活性+——主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。修复紫外光引起的DNA损伤DNA复制的主要聚合酶，还具有3′-5′外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性6/13/202327拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反响不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。

拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。二者共同控制DNA的拓扑结构。1.3.2拓扑异构酶：催化DNA的拓扑链环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。除链环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反响的酶称为拓扑异构酶(Topo，解超螺旋酶)6/13/202328TopoⅠ：切开DNA中的一条链，与另一条链解缠绕或再缠绕→连接TopoⅡ同时切开DNA双链解旋或再螺旋→连接6/13/202329本质：切断DNA磷酸二酯键改变DNA的链环数，再连接兼具DNA内切酶、连接酶的性质断裂、连接反响相互耦联不能连接事先已经存在的断裂DNA6/13/2023306/13/2023316/13/2023321.3.3解螺旋酶〔解链酶〕：通过水解ATP将DNA两条链翻开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。1.3.4单链结合蛋白(SSB-single-strandbindingprotein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。6/13/202333引发酶及引发体引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n′、n′′和i组成。引发酶：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物〔Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。引发体可以沿模板链5’3’方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。移动和引发均需要ATP提供能量，引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。以DNA为模板合成一段RNA,作为合成DNA的引物。6/13/202334DNA中一条链有切口，切口一端是3′-OH，另一端是5′-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使切口连接。不能将两条游离的DNA单链连接起来。DNA连接酶大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，那么要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。

6/13/2023356/13/202336连接酶的反响机制：酶+NAD+(ATP)酶-AMP+烟酰胺单核苷酸〔PPi〕酶-AMP+P-5‘-DNA酶+AMP-P-5’-DNADNA-3’-OH+AMP-P-5’-DNADNA-3’-O-P-5’-DNA+AMPDNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用6/13/202337酶-AMPAMP-P-5’-DNA磷酰胺键以焦磷酸活化磷原子6/13/202338拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物DNA双链′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质6/13/202339拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物拓扑异构酶与DNA双链结合，解开超螺旋。′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质6/13/202340拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物解链酶解开DNA双螺旋′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质6/13/202341拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物单链结合蛋白防止复螺旋′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质6/13/202342拓扑异构酶解链酶单链结合蛋白DNA聚合酶引物酶及引发体DNA连接酶引物引物酶合成引物′5′3′5′3DNA复制有关的酶和蛋白质6/13/2023431.4

DNA的半不连续复制

1968年由冈崎通过实验证明DNA复制是半不连续的6/13/202344冈崎片段的发现〔1968〕：同位素实验，3HdT短时间内为DNA小片段一段时间后检测到DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累——证明DNA复制中有小片段合成。由于U替代dT，被尿嘧啶-DNA-糖苷酶切除。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段〔冈崎片段〕中。后两个实验说明：在DNA复制时只有一条链是不连续的！6/13/202345领头链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链〔前导链〕。随后链—在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链〔滞后链〕。这些不连续的片断，称为冈崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸〔核小体的DNA单位〕。原核生物中1000-2000个核苷酸。半不连续复制〔semidiscontinuousreplication〕—在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。

6/13/2023463‘5‘3‘5‘1.4.2半不连续复制6/13/202347冈崎片段合成后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物并催化合成一段DNA填补留下的空隙。再由DNA连接酶把他们连成一条完整的子代链，称为滞后链。6/13/2023481.5

E.coli.染色体DNA复制过程

起始延伸终止6/13/202349解链引发延长复制起点RNA前体复制的起始6/13/202350大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列很保守，有两组短的重复：3个13bp的序列和4个9bp的序列6/13/20235120个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB〔解螺旋酶〕在DnaC协助下与开放复合物结合，进一步解链。解链时带来的扭曲张力还需DNA旋转酶〔属DNA拓扑异构酶Ⅱ〕引入负超螺旋消除。6/13/202352单链结合蛋白(SSB〕结合在单链区，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体〔引发体〕，以DNA为模板合成RNA引物〔6-10个碱基〕——引发6/13/202353复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，合成其互补单链。解链6/13/202354引发体在复制叉上移动，识别合成的起始位点，引发RNA引物的合成。领头链先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板〔3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，随后链也开始合成其引物。在引物的3’端为游离的羟基。复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物RNA引物合成DnaB蛋白活化引物合成酶。引物长度约为几个至10个核苷酸，与复制叉移动的方向相同，〔引物酶的底物是核苷三磷酸〕5’端含3个磷酸残基，6/13/202355大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质SSB解链酶引物引物酶拓扑异构酶打开DNA超螺链打开双螺旋合成防止复螺旋6/13/202356复制叉拓扑异构酶解螺旋酶引物单链结合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA聚合酶Ш的催化下，以脱氧核糖核苷酸为底物，在RNA引物的3′端加上脱氧核糖核苷酸。

1.5.2DNA链的延伸6/13/202357DNA链的延伸以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是3′5′走向，与之互补的DNA能以5′3′的方向连续合成，称为前导链（领头链）。另一条模板链是5′3′走向，与其互补的DNA也是5′3′方向合成，与复制叉移动方向正好相反，随复制叉的移动，形成许多不连续的片断，称为冈崎片断。每个冈崎片段的合成也都需要引物。6/13/202358延伸前导链只需要一个RNA引物，随后链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物。链的延长反响由DNApol.Ⅲ催化。复制体：在DNA合成的生长点〔既复制叉上〕分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制。6/13/202359α、ε和θ三种亚基组成核心酶,核心酶形成二聚体β-亚基犹如一个夹子夹住DNA分子，并向前滑动，使DNA聚合酶在完成复制前不再脱离DNA6/13/202360复制体沿着复制叉方向前进，同时进行前导链和滞后链的合成。一分子的DNApolIII.协同合成前导链和滞后链，因此滞后链必须绕成一个突环。5’3’3’5’6/13/202361DNA合成的终止E

E.coli有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白——

tus序列一：terEterDterA序列二：terFterBterC共6个终止位点。6/13/202362每个区域只对一个方向的复制叉起作用Tus蛋白-ter复合物阻止一个方向的复制叉前移(通过抑制DNA解旋酶而发挥终止作用)终止两个复制叉向前移动，最后在终止区相遇并停止复制，由DNA聚合酶Ⅰ填补空隙，最后由连接酶封口。结果形成两个DNA双股螺旋分子。6/13/202364原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´DNA连接酶6/13/2023651.6真核生物染色体DNA的复制

真核和原核DNA复制比较α、β、γ、δ、εδ负责核DNA的复制γ负责线粒体DNA的复制较慢较快6/13/202366在真核细胞内有五种DNA聚合酶〔与细菌DNA聚合酶的性质根本相同：底物、模板、引物、方向〕αβγδε定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3-5外切--+++酶活性功能引物合成修复作用线粒体DNA的复制核DNA的复制修复作用6/13/202367真核生物中DNA的复制特点1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp.3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，以保持端粒的一定长度。6/13/202368真核生物染色体DNA复制过程中组蛋白的装配核小体的结构〔200bp左右〕在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个翻开，组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上，新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。因此，DNA的复制是半保存的，而组蛋白那么是全保存的。6/13/202369真核生物染色体DNA末端复制的问题真核生物线状染色体在复制最后，5′末端RNA引物被切除后，无法向原核那样填补空缺，如果没有特殊的机制合成末端序列，将造成5′末端序列缩短，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。通过端粒酶催化形成端粒结构来解决原核生物染色体DNA是环状的，其随后链的5‘最末端冈崎片断的RNA引物被切除后可借助另半圈DNA连向前延伸来填补，6/13/202370复制叉复制叉终止区端粒结构3535端粒结构端粒酶是含RNA的逆转录酶端粒酶与细胞老化有关端粒〔telomeres〕：是真核细胞染色体末端所特有的结构，有许多串〔1000串或更多〕短的重复序列组成，通常3′末端链是富含G的短序列。端粒酶:含有RNA和蛋白质〔起DNA聚合酶的作用〕两种组分，RNA分子约150b，含有与重复端粒结构互补的一个片断，可作为端粒链合成的模板。6/13/2023711.7确保DNA复制忠实性的机制1、采用DNA聚合酶催化聚合反响2、依赖DNA聚合酶核酸外切酶活性3、使用RNA引物4、依赖核苷酸代谢库调节系统(保证dNTP的正常水平),多种修复系统6/13/2023721.8DNA复制的其它方式大肠杆菌双链环状DNA的复制〔一个复制起点，双向复制〕真核细胞线状染色体DNA的复制方式〔多个复制起点，双向复制〕单向滚环式复制〔噬菌体X174DNA—单链环状〕3D-环式复制方式〔线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步；或同步为2-D环〕切开正链，以负链为模板开始复制6/13/2023732.1DNA的损伤某些理化因子〔紫外线、电离辐射和化学诱变剂等〕作用于DNA，造成其结构和功能的破坏，从而引起生物突变和致死的效应——DNA的损伤常见的DNA损伤方式——嘧啶二聚体的形成2DNA的损伤与修复6/13/2023741、DNA分子的自发损伤1〕碱基错配：尽管DNA聚合酶具有校对修复功能仍存在极少量的错配〔10-10〕2〕自发性化学变化：碱基异构碱基脱氨基脱嘌呤、脱嘧啶碱基修饰链断裂3〕物理因素引发的损伤紫外线电离辐射

DNA链断裂交联4〕化学因素引发的损伤

烷化剂对DNA的损伤：碱基烷基化、碱基脱落断链、交联

碱基修饰剂、类似物对DNA的损伤人工促变剂、抗癌药物亚硝酸盐、黄曲霉毒素6/13/2023752、DNA损伤的后果1〕DNA分子的改变：点突变、缺失、插入、倒位、易位、链断裂2〕DNA损伤的结果：〔1〕致死性〔2〕丧失某些功能〔3〕改变基因型而不改变表现型〔4〕发生有利于物种生存的结果，生物进化6/13/2023766/13/202377在一定条件下，生物体能使DNA的损伤得到修复:暗修复2.1光裂合酶修复2.2切除修复2.3重组修复2.4诱导修复〔SOS修复〕2.5错配修复2.2DNA的损伤6/13/202378

光复活：400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上TT〔CCCT〕二聚体。〔包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无〕切除修复：将DNA分子中的受损伤局部切除，以完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶均参与。〔发生在DNA复制前〕重组修复〔发生在复制后〕：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。P318诱导修复：造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反响〔SOSresponse〕。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。所以会有2种结果：修复或变异〔进化〕。6/13/202379光复合酶特异地和嘧啶二聚体结合2.1DNA紫外线损伤的光裂合酶修复

〔光复活作用—直接修复〕酶被可见光激活解聚二聚体后酶被释放6/13/202380

2.2切除修复一般DNA的两条链只有一条受损伤，在一系列酶的作用下可将损伤局部切除，根据互补链的序列对其进行修复。6/13/2023812.3DNA的重组修复是复制后的修复DNA链的损伤并未除去一直只存在母链上！！假设干代后相当于被稀释。胸腺嘧啶二聚体6/13/202382

2.4SOS修复

为DNA的损伤所诱导，而产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而防止了死亡，可是却带来了高的突变率〔所以会有2种结果：修复或变异〔进化〕，这属于倾向过失的修复。6/13/202383

2.5错配修复

DNA在复制中发生错配，如果新合成的链被校对，基因编码信息可得到恢复；但如果模板链被校对，突变就被固定。

生物体内存在错配修复系统：能够识别“新〞“旧〞链！(依据甲基化)

6/13/202384

3DNA的突变

概念：DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。产生：DNA在复制中可能产生错配，但自然条件下发生的突变率非常低某些物理化学因素，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂〔烷化剂、碱基类似物、嵌入染料〕等6/13/202385自然条件下发生的突变成为自然突变，突变率非常低，能提高突变的物理或化学因子称为诱变剂。碱基类似物(baseanalog〕：5-溴尿嘧啶碱基修饰剂(basemodifier)：亚硝酸嵌入染料(intercalationdye)：吖啶橙、溴化乙锭紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation6/13/202386诱变因素及突变类型6/13/202387碱基对的置换(substitution)转换：两种嘌呤或两种嘧啶之间互换〔常见〕颠换：嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间互换移码突变(framesshiftmutation)突变分子改变的类型6/13/202388转换野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-点突变〔HNO2、NH2OH、烷化剂等〕插入或缺失1-2个碱基

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T移码突变(framesshiftmutation)6/13/202389移码突变由插入或缺失单个或2个碱基而改变整个基因序列、阅读框架的突变，称为移码突变。6/13/202390DNA的合成方式：DNA的复制：以DNA为模板合成DNA。逆转录：以RNA为模板合成DNA。修复合成〔DNA聚合酶I、连接酶、修复酶系统等〕6/13/202391第二节RNA的生物合成转录〔transcription〕：以DNA的一条链为模板在RNA聚合酶催化下，按照碱基配对原那么，合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链的过程称为转录。6/13/2023921958，Crick，中心法那么转录——DNA指导下RNA的合成6/13/202393DNA复制：以DNA为模板合成DNA，遗传信息自上一代细胞向下一代细胞传递转录：以DNA为模板合成RNA，遗传信息自DNA转录至RNA分子翻译：以mRNA为模板合成蛋白质，遗传信息表达至蛋白质逆转录：以RNA为模板合成DNA〔RNA病毒、真核细胞的端粒酶〕RNA复制：以RNA为模板合成RNA〔RNA病毒〕6/13/202394顺式作用元件调节转录的DNA序列，如启动子、终止子、增强子反式作用因子可与顺式作用元件结合的调节蛋白；如启动转录因子、终止因子RNA聚合酶几个有关的概念转录的主要酶，即依赖DNA的RNA聚合酶加工转录产生的RNA的切割、加帽、加尾和化学修饰〔如形成稀有碱基〕DDDP：依赖DNA的DNA聚合酶DDRP：依赖DNA的RNA聚合酶6/13/202395转录的不对称性(asymmetrictranscription)：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链〔无意义链，负链〕：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链〔编码链，正链〕在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。6/13/202396转录产物：mRNA、rRNA、tRNA、各种小RNA基因表达的产物:RNA和蛋白质转录起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因〔真核〕——单顺反子mRNA，也可以是多个基因〔原核〕——多顺反子mRNA。6/13/2023971.1E.coliRNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶只有一种,全酶由5种亚基α2ββ’σ组成，另有两个Zn2+σ因子与其它局部的结合不是十分紧密，它易与α2ββ’别离，没有σ、亚基的酶称为核心酶——只催化链的延长，对起始无作用。五种亚基的功能分别为：α亚基：与启动子结合功能。β亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。β’亚基：与DNA模板结合功能。σ亚基：识别起始位点。

6/13/202398E.coli

RNA聚合酶的特点：反响底物：NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)，DNA为模板、Mg2+促进聚合反响。RNA聚合酶不需要引物，合成方向53。6/13/2023991.2

E.coliRNA的转录过程：

起始位点的识别

转录起始链的延伸转录终止6/13/2023100起始位点的识别RNA的合成不需要引物。体外实验证明，不含σ亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有σ亚基时就会选择正确的起点。σ亚基起着识别DNA分子上的起始信号〔启动子——指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列〕的作用。启动子的结构至少由三局部组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点〔富含AT碱基，利于双链翻开〕；第三局部是RNA合成的起始点。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1转录起始点5’3’3’5’35序列

Sextama框10序列Pribnow框6/13/2023101转录起始RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。参加的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。完成最初的几个〔2-9〕核苷酸连接后，σ亚基就会被释放脱离核心酶。所形成的启动子、全酶和RNA链复合物称为三元起始复合物。因子仅与起始有关，RNA的合成一旦开始，便被释放E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链6/13/2023102RNA链的延伸DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3’-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从53转录泡RNA聚合酶DNA模板RNA

6/13/2023103RNA聚合酶催化的反响ACGACGUU模板DNA5´3´5´3´新合成RNA6/13/20231041.2.4转录终止〔终止子和终止因子〕在DNA分子上〔基因末端〕提供转录停止信号的DNA序列称为终止子〔terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。〔RNA聚合酶只能感受已经转录的信号序列〕终止因子，协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子〔蛋白质〕。终止因子ρ因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。大肠杆菌有两类终止子：〔1〕不依赖于ρ因子的终止子〔强〕〔2〕依赖ρ因子的终止子〔弱终止子〕6/13/2023105不依赖于ρ因子的终止子有2个特征〔强终止子〕①在DNA中，在转录单位的终点之前都有一个回文结构，其转录本形成发卡结构，且柄部富含GC碱基对。②终点前大约有6个连续的A，它转录成U。模板链5335富含AT区CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA回文结构富含GC区转录方向6/13/2023106寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。依赖ρ的终止子，必需在ρ因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。6/13/2023107有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读〔readthrough〕能够引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子〔antiterminationfactors〕因子是一个碱性的蛋白,三个二聚体组成.与合成的RNA结合,移动到终止信号,再与RNA聚合酶结合,使之离开摸板.6/13/2023108RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段53RNA启动子〔promoter)

终止子(terminator)5RNA聚合酶5353553离开转录泡6/13/2023109根本原那么与原核相似，但真核基因的转录更复杂，RNA聚合酶不相同启动子有三类，分别由RNA聚合酶I、II、III进行转录。真核生物的启动子由转录因子，而不是RNA聚合酶识别〔没有对应的因子〕转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子〔蛋白质〕参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。多种转录因子和RNA聚合酶在起点形成前起始复合物，起始转录。1.3真核生物的转录6/13/2023110产物α-鹅膏蕈碱对酶的作用酶类分布反应条件ⅡIⅢ核仁核质核质rRNAmRNAtRNA不抑制低浓度抑制高浓度抑制低离子强度,要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度分子量都在50万左右

真核生物RNA聚合酶6/13/20231111.4RNA生物合成的抑制剂1.4.1嘌呤和嘧啶类似物：人工合成的碱基类似物能够抑制和干扰核酸的合成。如NH2SHSH作为代谢拮抗物抑制合成酶类或直接掺到核酸分子中，形成异常RNA或DNA。NH2NH2OHNFNH2SH6/13/2023112DNA模板功能的抑制物：可以与DNA模板结合，抑制其复制和转录〔1〕烷化剂：使DNA发生烷基化，发生在G-N7，A-N1、N3N7；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干扰复制或转录；或引起碱基错配。〔2〕放线菌素：放线菌素D与DNA形成非共价的复合物，抑制其模板功能〔低浓度抑制转录，较高浓度抑制复制〕。具有类似作用的还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。〔3〕嵌入染料：可插入双链DNA分子相邻的碱基对之间，一般具有芳香族发色团。吖啶类染料；溴化乙锭〔EB〕。EB是一种高灵敏的荧光试剂，常用来检测DNA和RNA。与DNA结合后抑制其复制和转录。6/13/2023113嘌呤和嘧啶类似物：可通过抑制核苷酸的合成，抑制RNA生物合成。还能掺入核酸分子中去，形成异常DNA、RNA，影响核酸功能。人工合成的主要有：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶碱基类似物进入体内后需转变成相应的核苷酸，才表现出抑制作用。烷化剂：氮芥〔二〔氯乙基〕胺的衍生物〕、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺类。它们带有活性烷基，使DNA烷基化。烷化位点：鸟嘌呤N7，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1烷基化后，碱基易被水解下来，留下的空隙可干扰DNA复制或引起错误碱基掺入。带有双功能基团的烷化剂，可同时与DNA两条链结合，使双链DNA交联，从而失去模板功能。放线菌素D：有抗菌和抗癌作用。它可与DNA形成非共价复合物，使其多肽局部在DNA的“浅沟〞上如同阻遏蛋白一样，抑制DNA的转录。6/13/2023114此类机理的放线菌素还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。嵌入染料：扁平芳香族染料，可插入双链DNA相邻碱基对之间，使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，从而导致移码突变，并能抑制RNA链的起始及质粒的复制。溴化乙锭、吖啶类染料〔原黄素、吖啶黄、吖啶橙等〕。RNA聚合酶的抑制物〔1〕利福霉素包括其衍生物利福平，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性。强烈抑制革兰氏阳性菌和结核杆菌，它主要抑制RNA合成的起始。〔2〕

利链菌素与细菌RNA聚合酶β亚基结合，抑制转录过程中链的延长。〔3〕

α-鹅膏蕈碱主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，对细菌的RNA聚合酶作用极小。6/13/20231151.4.3RNA聚合酶抑制物〔1〕利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制结核杆菌，杀死麻疯杆菌，在体外有抗病毒作用。〔2〕利链霉素：与细菌RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反响。〔3〕-鹅膏蕈碱：抑制真核生物RNA聚合酶活性。6/13/20231162RNA的转录后加工(post-transcriptionalprocessing)在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物〔primarytranscript〕往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。6/13/20231172.1mRNA前体的加工〔真核〕：原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译〔半寿期短〕。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。真核生物mRNA〔半寿期较长〕原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA〔heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)，其中大约25%需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。加工包括：〔1〕3’端添加polyA“尾巴〞；〔2〕5’端连接“帽子〞结构〔m7G5ppp5NmpNp-〕；〔3〕hnRNA被剪接，把内含子〔DNA上非编码序列〕转录序列剪掉，把外显子〔DNA上的编码序列〕转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。〔4〕分子内部的核苷酸甲基化修饰。6/13/20231186/13/20231192.2tRNA前体的加工：原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括：〔1〕由核酸内切酶切除前体上3和5端上多余的核苷酸；〔2〕由核酸外切酶逐个在3切去附加序列，进行修剪。〔3〕3端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。〔接受活化AA〕〔4〕核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。

6/13/20231206/13/2023121原核与真核生物的rRNA转录后也都需要进行加工。原核：刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化〔核糖2-羟基〕修饰，后逐步裂解〔核酸酶的切割〕。真核：45S〔哺乳动物〕、38S〔果蝇〕、37S〔酵母〕P16P23P516S23S5S〔一般不含甲基化〕28S18S5.8S2.3rRNA前体的加工：45S或38S37S26S17S5.8S真核rRNA的甲基化程度比原核高〔核糖2-羟基〕rRNA原初转录物30S研究四膜虫rRNA前体的拼接时发现ribozyme6/13/20231226/13/20231231.模板：DNA2.原料：核苷酸3.合成方向：5′→3′4.酶：依赖DNA的RNA聚合酶5.碱基互补配对规律6.产物：多聚核苷酸链相同点：2.4转录和复制的区别6/13/2023124不同点：复制转录模板两股链均作为模板模板链作为模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代DNA双链mRNA;tRNA;rRNA配对A-T；G-CA-U；T-A;G-C引物RNA引物不需要引物方式(特点)半保存复制不对称转录6/13/2023125两个阶段〔1〕其单链RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的β亚基。〔2〕复制酶的β亚基可与来自寄主细胞的亚基αδ自动装配成RNA复制酶，可进行RNA的复制，以分子中单链RNA为模板〔正链〕，复制出一条新的RNA链〔负链〕，再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。

3RNA的复制〔噬菌体Qβ和灰质炎病毒〕某些RNA病毒可以以自身RNA为模板进行复制。5RNA-533RNA+释放释放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均为5‘3’不同的RNA病毒复制方式不同P333。6/13/2023126病毒RNA复制的主要方式单链〔+〕RNA病毒的复制方式〔噬菌体Qβ和灰质炎病毒〕(只含病毒正链RNA)

单链〔-〕RNA病毒的复制方式〔狂犬病毒〕(病毒负链RNA+复制酶)；双链RNA病毒的复制方式〔呼肠狐病毒〕(双链RNA+复制酶)；致癌RNA病毒6/13/2023127不同RNA病毒合成mRNA的途径可以分4类逆转录病毒噬菌体Qβ狂犬病毒〔带有复制酶〕呼肠孤病毒〔带有复制酶〕逆转录酶6/13/20231281、正链RNA病毒〔mRNA〕：噬菌体Qβ、灰质炎病毒等。进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA〔+〕和蛋白质装配成病毒颗粒。

2、负链RNA病毒〔带有复制酶〕：狂犬病毒等此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA〔mRNA〕，再以正链RNA为模板，合成