细胞的传代培养和细胞计数法_第1页
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文档简介

细胞的传代培养和细胞计数法第一页,共十六页,编辑于2023年,星期三人癌细胞系传代培养

1.观察:培养细胞生长活跃,占瓶底80%-90%,无污染;2.弃废液:倒掉瓶中培养液,尽量沥干液体;3.漂洗:加1ml0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液;4.消化:再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,保留约0.3ml,室温放置3~5min;5.吹打:镜下看到细胞收缩变园,加1~2ml含血清培养液,用吸管按顺序轻轻吹打,避免出现泡沫;6.计数:取样,计数,调整细胞浓度;7.接种及培养:按104

细胞/ml接种,37℃、5%CO2

,饱和湿度条件下培养。第二页,共十六页,编辑于2023年,星期三注意事项

细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。细胞混杂生长时,可根据需要选择合适的方法纯化细胞。

第三页,共十六页,编辑于2023年,星期三第四页,共十六页,编辑于2023年,星期三第五页,共十六页,编辑于2023年,星期三第六页,共十六页,编辑于2023年,星期三血球计数板法制备细胞悬液:细胞密度>104/ml,细胞过多时需适当稀释,单个细胞率>95%。加样:混悬细胞,取少许细胞悬液,从计数池一侧加入,不要溢出或出现气泡。计数:10倍物镜下计数四角大方格内的细胞,压线者只计左边线和上边线。计算:细胞数/ml=(四大格细胞总数/4)×104×稀释倍数第七页,共十六页,编辑于2023年,星期三第八页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞活力测定-台盼蓝染色法制备单个细胞悬液:105~106/ml染色:0.04%台盼蓝染色1min(9滴细胞悬液+1滴0.4%台盼蓝),3min内计数计数:用血细胞计数板镜下分别计数活细胞(染料拒染)和死细胞(呈淡蓝色)计算细胞活力:活细胞率(%)=[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]×100第九页,共十六页,编辑于2023年,星期三第十页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞密度调整稀释公式:C1·V1=C2·V2稀释前细胞密度C1,溶液体积V1稀释后细胞密度C2,溶液体积V2第十一页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞计数106/mlCellsusspension105/ml104/ml103/ml0.1ml0.1ml0.1mlMedium0.9ml第十二页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞生长曲线测定-计数法DT=t×lg2÷(lgNt-lgNo)第十三页,共十六页,编辑于2023年,星期三培养细胞的纯化方法机械刮除法:用细胞刮刮出不需要的细胞差速粘附法:成纤维样细胞,上皮样细胞选择性酶消化法:金属管套取需要的细胞密度梯度离心法:细胞漂浮密度,

Ficoll,Percoll克隆化培养法:琼脂法,有限稀释法免疫磁珠分离法:细胞表面标志,免疫磁珠速度沉降法:细胞大小,离心淘洗技术电泳分离法:细胞表面电荷第十四页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞培养过程中常见的问题培养液pH值快速偏离:CO2浓度异常,培养瓶盖过紧;细菌、酵母或霉菌污染培养液出现沉淀:细菌或霉菌污染细胞不贴壁:胰酶过度消化细胞,支原体污染,缺乏附着因子

第十五页,共十六页,编辑于2023年,星期三细胞死亡:孵箱中缺CO2

,孵箱温度不稳定,细胞冻融损伤,渗透压改变,培养液中毒性代谢产物堆积细胞生长缓慢:培养液或血清改变,基本促

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