分子生物学常用技术

分子生物学常用技术

分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片2021/5/92第一节凝胶电泳

(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:迁移率

Q:电荷量

r:粒子半径（分子量）η:介质粘度

2021/5/93电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

2021/5/94一、琼脂糖凝胶电泳

(agarosegelelectrophoresis)

分离核酸原理操作要点应用范围2021/5/95（一）分离核酸原理

电荷效应

分子筛效应

分子构象2021/5/961.电荷效应核酸是两性电解质

pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3

,负电荷，正极2021/5/972021/5/982.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢2021/5/993.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA

+-2021/5/910（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择

DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件

DNA电泳染色

DNA片段的回收2021/5/9111.支持物2021/5/912商品化的琼脂糖2021/5/913琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃<70℃80~90℃80~90℃机械强度中差高高分辨率中差中高2021/5/9142.凝胶浓度的选择2021/5/915凝胶的制备2021/5/9162021/5/9172021/5/9183.DNAmarker2021/5/919DNAmarker2021/5/920DNA长度标准曲线2021/5/9214.电泳缓冲液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

2021/5/9225.样品制备上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/二甲苯青

2021/5/923点样2021/5/9246.电泳条件潜水电泳恒压电泳

低压:1~2V/cm

中压:8~10V/cm

高压电泳：>几十V/cm温度：15~25℃

2021/5/925潜水电泳2021/5/9267.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,EB)

结构及染色原理染色方法加入凝胶液中

电泳结束后染色2021/5/927EB染色原理2021/5/9282021/5/929紫外灯下显色2021/5/9308.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法

透析袋电洗脱法(>5kb)DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)2021/5/931（三）应用范围

DNA的分离、纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离、鉴定杂交分析

PCR产物的分离鉴定2021/5/932琼脂糖凝胶电泳2021/5/933二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分离原理操作要点优点应用范围2021/5/934（一）分离原理

电荷效应分子筛效应2021/5/935PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)

交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis)

催化剂－过硫酸胺(AP)

加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)2021/5/936聚丙烯酰胺凝胶2021/5/937（二）操作要点凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收2021/5/9381.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA尿素甲酰胺SDS2021/5/9392.凝胶浓度的选择2021/5/9402021/5/9413.凝胶液的配制

试剂(ml)制备浓度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml2021/5/942PAGE装置2021/5/9432021/5/9442021/5/9452021/5/946电泳2021/5/9474.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法

银盐染色法甲醛还原放射自显影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

2021/5/9485.DNA片段的回收压碎浸泡法<1kb

纯度高，回收率低2021/5/949（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高

2021/5/950（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析2021/5/951第二节分子杂交

分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术2021/5/952一、分子杂交的基本原理

核酸的变性和复性2021/5/953分子杂交DNA-DNA2021/5/954DNA-RNA2021/5/955杂交条件

靶分子探针杂交袋杂交炉2021/5/956杂交种类被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交()2021/5/957二、固相支持物固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好

2021/5/958固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龙膜(nylonmembrane)2021/5/9591.硝酸纤维素滤膜

特点吸附ssDNA和RNA

杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段(<200bp)结合能力弱2021/5/9602.尼龙膜特点结合能力强

可反复杂交

韧性强

适于电转移印迹法对DNA小片段(10bp)结合能力强不足杂交信号本底较高

2021/5/961分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:00)地点9教讲演厅(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地点：逸夫楼3楼生化实验室2021/5/962三、探针(probe)探针的概念探针的类型

标记物的种类标记方法2021/5/9631.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质抗原－抗体配体－受体同源DNA/RNA2021/5/9642.探针的类型基因组DNA探针

cDNA探针

RNA探针寡核苷酸探针蛋白质或多肽探针2021/5/9653.标记物的种类放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性标记物生物素地高辛荧光素酶

2021/5/9664.核酸探针的放射性标记方法

DNA缺口平移标记法随机引物标记法

DNA的5’末端标记

2021/5/967缺口翻译特点均一标记制备dsDNA探针2021/5/968随机引物标记法(randompriming)

随机引物6nt含有各种可能的排列顺序特点放射比活性>缺口翻译操作简便DNA/cDNA探针2021/5/9692021/5/970DNA的5’末端标记(5’endlabeling)

碱性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA/RNA探针

2021/5/971DNA的5’末端标记2021/5/972四、Southern杂交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印迹(blotting):转移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

2021/5/9731.印迹的方法

毛细管转移法

电转移法

真空转移法

2021/5/974毛细管转移法2021/5/975电转移法2021/5/976真空转移法2021/5/9772021/5/9782.Southern杂交的步骤2021/5/9793.Southern杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP2021/5/980五、Northern杂交

RNAblotting

步骤

总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色

应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量比较不同组织/细胞中基因的表达情况

2021/5/981Northern杂交2021/5/982六、Western杂交免疫印迹(immunoblotting)

SDS→转移→蛋白－第一抗体→标记的第二抗体(探针)→检测

应用蛋白质的定性定量分析2021/5/9832021/5/984免疫印迹2021/5/985

Southern,Northern&Western

待测物质

支持物

探针

转移方式Southern

DNANC单链核酸

毛细管/电/真空

Northern

RNANC/尼龙单链核酸

毛细管/电/真空

Western

蛋白质NC/PVDF

抗体电转移

2021/5/986七、原位杂交

(insituhybridization)定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交

基本程序细胞/组织固定预杂交杂交冲洗杂交信号检测分析结果

2021/5/987组织切片2021/5/9882021/5/989八、斑点杂交

(dothybridization)

2021/5/990第三节PCR技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用2021/5/991一、PCR的发展简史1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想1985年,Mullis等发明了PCR技术1988年,PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪

2021/5/992二、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制三个步骤变性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

2021/5/993PCR的原理2021/5/994PCR的扩增产物cycle12345n长片段

246810短片段

002822长＋短

21222324252n2021/5/995标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4种dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U总体积：100ul2021/5/9962021/5/997三、PCR的影响因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4种dNTP

Mg2+循环条件

2021/5/998模板

DNARNAcDNA对模板的纯度要求低2021/5/999引物长度：15～30nt

G+C含量：40~60%

碱基的随机分布避免引物自身和引物之间的互补引物的3’端引物的5’端引物浓度：0.2~1umol/L

2021/5/9100TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

2021/5/9101底物4种dNTP

的浓度相等终浓度：200umol/L

2021/5/9102Mg2+

浓度:1.5～2.0mmol/L

过高:非特异扩增

过低:反应产物减少2021/5/9103循环条件变性温度和时间:90~96℃,30~60s退火温度和时间:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸温度和时间70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循环次数:25～35

2021/5/9104四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(insituPCR)实时PCR(realtimePCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)2021/5/9105原位PCR原位杂交＋PCR程序固定细胞/组织样品→PCR前处理→PCR扩增→原位杂交及检测

2021/5/9106实时PCR的原理2021/5/9107五、PCR的应用分子生物学研究临床医学2021/5/9108分子生物学研究基因克隆

DNA序列测定基因的体外定点突变

突变分析(PCR-SSCP)

基因定量

2021/5/9109临床医学病原体诊断

遗传病的基因诊断

肿瘤检测

法医学

2021/5/9110第四节DNA序列测定

Sanger双脱氧链终止法(1977)

Maxam-Gilbert化学裂解法(1977)2021/5/9111Sanger双脱氧链终止法原理－DNA复制

反应条件模板引物

dNTP（其中一种带放射性标记）

ddNTP

DNA聚合酶2021/5/9112DNA的复制2021/5/91132’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP