实验四离心技术及物质代谢实验

实验四离心技术及物质代谢实验第一页，共三十三页，编辑于2023年，星期二离心技术概念：根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。应用：分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。第二页，共三十三页，编辑于2023年，星期二基本原理

F：粒子在离心场中所受的离心力

a：粒子旋转的加速度

m：沉降粒子的有效质量

ω：粒子旋转的角速度

r：粒子的旋转半径(cm)，离心力F=第三页，共三十三页，编辑于2023年，星期二

RCF(relative

centrifugal

force)：相对离心力

rpm(revolutionsperminute)

：每分钟转速

低速离心时常以转速“rpm”来表示

高速离心时则以“g”表示

相对离心力

离心力相对于重力的倍数，单位是g第四页，共三十三页，编辑于2023年，星期二沉降系数（S）:超速离心时，颗粒在离心场中的沉降速度用沉降系数来表示，即物质在单位离心力场下的沉降速度。单位：Svedberg，1S=10-13s是是物质特有的物理常数，可间接反应分子量的大小。离心分离技术的基本理论数据，与物质的大小、形状、密度及介质的密度、粘度都有关，通过对离心力和离心介质的选择，即可分离纯化出不同质量大小和物理形状的物质。

第五页，共三十三页，编辑于2023年，星期二另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。第六页，共三十三页，编辑于2023年，星期二

离心机的类型和主要构造

类型

工业用离心机离心机制备性离心机

实验用离心机分析性离心机

普通离心机：<6000rpm

高速离心机：6000～20000rpm

超速离心机：≥20000rpm制备性离心机第七页，共三十三页，编辑于2023年，星期二主要构造

转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系统，制动装置，指示表盘第八页，共三十三页，编辑于2023年，星期二转头

1．角式转头

第九页，共三十三页，编辑于2023年，星期二

2．荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。

3．区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。

4．垂直转头：其离心管是垂直放置的。

5．连续流动转头：转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。

最大额定转速——一定的使用限度，使用一定次数或一定时间后递减10%。

第十页，共三十三页，编辑于2023年，星期二离心管

不锈钢和塑料离心管，管帽防止样品溢出。

第十一页，共三十三页，编辑于2023年，星期二离心操作的注意事项使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。第十二页，共三十三页，编辑于2023年，星期二装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。离心过程中不得随意离开第十三页，共三十三页，编辑于2023年，星期二物质代谢实验

实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定血清胆固醇测定血清甘油三酯测定实验二十、邻甲苯胺法测血糖含量第十四页，共三十三页，编辑于2023年，星期二实验二十一、糖酵解中间产物的鉴定

【实验目的】

检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。

【实验原理】第十五页，共三十三页，编辑于2023年，星期二糖酵解的反应过程见下图：第十六页，共三十三页，编辑于2023年，星期二将酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介质中（适宜的pH，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在3－磷酸甘油醛脱氢酶催化下进行的，－SH为3－磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加入一碘醋酸可与此酶的－SH起反应，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。酶-SH+ICH2COOH→酶S-CH2COOH+HI第十七页，共三十三页，编辑于2023年，星期二然后以硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与2，4－二硝基苯肼反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。第十八页，共三十三页，编辑于2023年，星期二第十九页，共三十三页，编辑于2023年，星期二【实验方法】取试管3支，编号，按下表进行操作．记录三管所发生的情况，并加以简要的分析．CCL3COOH的作用：强酸，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使3－磷酸甘油醛脱氢酶失活。硫酸肼的作用：稳定磷酸丙糖，使其不向其它方向转变。第二十页，共三十三页，编辑于2023年，星期二试剂（ml）123pH7.4磷酸盐缓冲液一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH酵母液水2.0

0.5

0.51.04.0－2.00.50.5－4.01.02.0－－－4.02.0混匀，在37℃－38℃恒温水浴中保温30分钟一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH

水－－－2.0

－－1.01.0

0.50.51.0－混匀，静置10分钟，离心,3000转/min,10分钟，再取三支试管，对号按下表操作上清液1mol/LNaOH

0.50.50.5

0.50.50.5混匀，在室温放置10分钟2，4－二硝基苯肼1mol/LNaOH0.53.50.53.50.53.5第二十一页，共三十三页，编辑于2023年，星期二实验注意事项：成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，生成的颜色比较稳定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制剂，使用移液管后必须彻底清洗移液管，否则易导致实验失败。第二十二页，共三十三页，编辑于2023年，星期二血清胆固醇测定（酶法）【实验目的】

1.了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。

2.掌握血清胆固醇测定的临床意义。第二十三页，共三十三页，编辑于2023年，星期二

血清中总胆固醇包括胆固醇酯(CE,70%)和游离型胆固醇(FC,30%)。胆固醇酯酶（CEH）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ­4­-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：【实验原理】第二十四页，共三十三页，编辑于2023年，星期二1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.取试管3支，编号，按下表操作。【实验方法】加入物（ul）测定管标准管空白管血清10--胆固醇标准液-10-蒸馏水--10酶应用液100010001000第二十五页，共三十三页，编辑于2023年，星期二【计算】ΔA标本

CHO（mmol/L）=——————×标准液浓度

ΔA标准

【标准液】

胆固醇5.17mmol/L（200mg/dL）

【正常参考范围】3.10～5.70mmol/L混匀后，37℃水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

第二十六页，共三十三页，编辑于2023年，星期二血清甘油三酯的测定（酶法）【实验目的】1、了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。

2、掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。第二十七页，共三十三页，编辑于2023年，星期二

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式如下：

甘油三酯+4H2O

脂蛋白脂酶甘油+脂肪酸甘油+ATP

甘油激酶/Mg2+

甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O2

甘油-3-磷酸氧化酶磷酸二羟丙酮+H2O22H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林过氧化物酶红色醌亚胺色素+4H2O【实验原理】第二十八页，共三十三页，编辑于2023年，星期二1.标本：不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA抗凝，不可用草酸盐、氟化物。2.取试管3支，编号，按下表操作。【实验方法】加入物（ul）测定管标准管空白管血清10--甘油三酯标准液-10-蒸馏水--10酶应用液100010001000第二十九页，共三十三页，编辑于2023年，星期二【计算】

ΔA标本甘油三酯（mmol/L）=——————×标准液浓度

ΔA标准【标准液】

甘油三酯2.26