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文档简介
实验细胞融合第一页,共十四页,编辑于2023年,星期二
杂交的目的-----制备单克隆抗体
第二页,共十四页,编辑于2023年,星期二杂交瘤技术的基本原理具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术,将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合,经过选择培养获取杂交细胞,这种细胞称为杂交瘤细胞(Hybridoma)。※:该细胞的特点:1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能;2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
第三页,共十四页,编辑于2023年,星期二杂交瘤技术基本过程示意图第四页,共十四页,编辑于2023年,星期二
HAT选择性培养
HAT分别代表次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨基碟呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶(thymidine,T)三种物质。细胞的DNA生物合成有两条途径:第五页,共十四页,编辑于2023年,星期二
ChoiceofanimalThemouseisusuallytheanimalofchoice.Suitablemousemyelomacelllinesarewidelyavailable,andgrownofhybridomasinmiceisusuallynoproblem.Allofthecurrentlyavailablemousemyelomalines,whicharesuitableforfusion,areofBALB/Corigin,6-8week,femalemouseisusuallyused.第六页,共十四页,编辑于2023年,星期二Choiceofmyelomacell
1.NS-1,
hasbeenverywidelyusedforhybridomaproduction.Whenculturedalone,itsynthesizesκlightchains.
2.X63andSp2/0arethecurrentlinesforfusion.Sp2/0hybridomaappeartobesomewhatmoreSensitivethanNS-1toenvironmentalconditions.第七页,共十四页,编辑于2023年,星期二Fusingagent
Allcurrenthybridomaworkusespolyethyleneglycol(PEG)asthefusingagent.TheexactmolecularweightPEGseemstobeunimportant.MostinvestigatorshaveusedPEGofmolecularweight500-6000.NotethatthenumberassignedtoPEGdoesnotnecessarilyindicateitsmolecularweight.concentrationofPEGrangefrom
30%to50%.Below30%,thefusionfrequencyislow,andabove50%,toxicitybecomesoverwhelming.第八页,共十四页,编辑于2023年,星期二动物免疫一、可溶性抗原1wk抗原50μg/只,溶于300μl生理盐水中,加入等量福氏完全佐剂(CFA)充分乳化,分颈、部皮下多点及腹腔注射;3wk抗原的剂量及注射的部位同上,仅将全佐改为半佐(IFA);5wk抗原50μg/只,溶于300μl生理盐水中,腹腔注射;加强融合前3~5天抗原20~30μg/只,溶于50μl生理盐水中,小鼠尾静脉注射以加强免疫。第九页,共十四页,编辑于2023年,星期二二、细胞抗原1wk细胞数量8×106个/只,洗涤三遍,用0.3~0.4ml的生理盐水重新悬浮,腹腔注射;3wk细胞数量6×106个
/只,细胞的预处理及注射的部位同上;5wk细胞数量5×106个
/只,细胞的预处理及注射的部位同上;加强融合前的4~5天细胞数量3×106个/只,加强免疫。
在以肿瘤细胞作免疫原时,为避免免疫过程中小鼠因生长肿
瘤而死亡。故用丝裂霉素处理免疫原细胞,抑制其生长繁殖
以防形成肿瘤。最后的加强免疫,肿瘤细胞可不经丝裂霉素
处理,因4~5天后即进行融合。第十页,共十四页,编辑于2023年,星期二免疫脾细胞的制备处死小鼠,固定于解剖架上打开腹腔,取出脾脏。置于120目的钢丝网中,将网移入盛有20ml生理盐水的平皿中,用注射针芯轻轻压磨,使其成为单个细胞悬液,吸取1ml细胞悬液(约5×106细胞),与骨髓瘤细胞SP2/0(5×105细胞)混合,离心后弃上清。※1、骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为1:102、一个脾脏可获约108个细胞第十一页,共十四页,编辑于2023年,星期二
1、取PEG溶液1.0ml缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌;2、静止1分钟;3、加HAT培养基4ml;细胞的融合:第十二页,共十四页,编辑于2023年,星期二4、取融合细胞悬液1ml,滴加在96孔培养板中,每孔1滴(约50μl);5、显微镜下观察融合细胞的状态。第十三页,共十四页,编
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