基因编辑技术的概念和原理

（优选）基因编辑技术的概念和原理当前第1页\共有40页\编于星期日\21点什么是基因编辑技术？基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。当前第2页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的研究背景传统的动物育种方法受到种源的限制，其程需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难，育种成果很难取得突破性进展。

当前第3页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的研究背景现代动物分子育种中，分子标记技术能够定位与经济性状相关的分子标记，锁定基因与性状的对应关系，从而快捷可靠地对动物后代进行筛选。但是，利用分子标记技术辅助筛选，改良的程度依然受限于品种自身已有的基因。所以，利用基因工程技术进行品种改良，可以突破种源的限制及种间杂交的瓶颈，获取新品种，因此分子育种更为本质和直接。当前第4页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的研究背景目前，获得突变体的常见方法是利用T-DNA或转座子构建大规模的随机插入突变体库，但是构建覆盖全基因组的饱和突变体库需要的工作量大且耗费的时间长。而通过定点突变的方法使目的基因完全失活，是一种最直接有效的研究特定基因功能的方法。当前第5页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的研究背景近年来，随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因组编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲除、敲入变得更为简单且高效。当前第6页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的优势与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。当前第7页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑原理现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreaksDSBs)激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)两条途径。当前第8页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑原理非同源末端连接（NHEJ）是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ机制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。当前第9页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑原理同源重组修复（HR）

是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。当前第10页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑原理当前第11页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑技术的种类目前主要有3种基因编辑技术，分别为：人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技术；转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技术；RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶技术(CRISPR-CasRGNs)。当前第12页\共有40页\编于星期日\21点1.ZFN基因组编辑技术ZFN技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区域发现了Cys2-His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。当前第13页\共有40页\编于星期日\21点ZFN由锌指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。当前第14页\共有40页\编于星期日\21点ZFN诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有3个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。当前第15页\共有40页\编于星期日\21点2.TALEN基因组编辑技术2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后，TALE特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN更广阔的应用潜力。当前第16页\共有40页\编于星期日\21点TALENs包含两个TALEN蛋白,每个TALEN都是由TALEarray与FokⅠ融合而成.其中一个TALEN靶向正义链上靶标位点,另一个则靶向反义链上的靶标位点.然后FokⅠ形成二聚体,在靶向序列中间的spacer处切割DNA,造成双链DNA断裂,随后细胞启动DNA损伤修复机制.针对不同的TALEN骨架,其最适宜的spacer长度不同,其长度范围一般为12~20bp.实验结果表明,TALENs在靶向DNA时,第一个碱基为T时其结合效果更佳。当前第17页\共有40页\编于星期日\21点目前，TALEN已经成功应用于酵母、哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶，与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。当前第18页\共有40页\编于星期日\21点3.CRISPR/Cas9基因组编辑技术1987年，Ishino等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系。当前第19页\共有40页\编于星期日\21点在这个系统中，只凭借一段RNA便能识别外来基因并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到2012年，Jinek等第一次在体外系统中CRISPR/Cas9为一种可编辑的短RNA介导的DNA核酸内切酶，标志着CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功问世。3.CRISPR/Cas9基因组编辑技术当前第20页\共有40页\编于星期日\21点CRISPR/Cas系统由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成.转录的sgRNA折叠成特定的三维结构后与Cas9蛋白形成复合体,指导Cas9核酸内切酶识别特定靶标位点,在PAM序列上游处切割DNA造成双链DNA断裂,并启动DNA损伤修复机制.从不同菌种中分离的CRISPR/Cas系统,其CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同,PAM序列也可能不同。当前第21页\共有40页\编于星期日\21点三种不同技术的比较当前第22页\共有40页\编于星期日\21点续表当前第23页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑新技术的用途基因功能研究基因治疗构建模式动物改造和培育新品种当前第24页\共有40页\编于星期日\21点1.基因功能研究基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节，但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体动物模型选育等一系列步骤，成功率受到多方面因素的限制。当前第25页\共有40页\编于星期日\21点1.基因功能研究即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术敲除大鼠或小鼠身上的某个基因一般也需要1年以上。基因编辑新技术则不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。当前第26页\共有40页\编于星期日\21点1.基因功能研究ZFN技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。当前第27页\共有40页\编于星期日\21点1.基因功能研究2009年，威斯康辛医学院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家机构使用ZFN技术，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同样带有该基因突变。当前第28页\共有40页\编于星期日\21点2.基因治疗传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因，但这种方法难以精准控制，可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位，在靶位点进行修正或进行基因切除，达到基因治疗的目的。当前第29页\共有40页\编于星期日\21点2.基因治疗Bacman等人利用TALEN技术清除了来自于病人线粒体内的有病DNA。这是TALEN首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。当前第30页\共有40页\编于星期日\21点2.基因治疗Li等人利用ZFN技术能在染色体上精确定位的优势，通过“剪切”和“粘贴”基因，在实验小鼠体内实现了血友病治疗，避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险，首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。当前第31页\共有40页\编于星期日\21点3.构建模式动物根据人类疾病所构建的动物模型，对研究这些疾病的发生及其治疗有着重要意义。基因打靶技术是在ES和同源重组技术的基础上发展起来的，模型构建耗时长、成本高，且模式动物的选择受到ES细胞的限制。当前第32页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑新技术不受ES细胞的限制，效率高，速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人Jaenisch与其同事最近利用CRISPR-Cas系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。3.构建模式动物当前第33页\共有40页\编于星期日\21点4.改造和培育新品种传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源DNA片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种。基因编辑技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。当前第34页\共有40页\编于星期日\21点Shukla等对玉米进行肌醇磷酸激酶1(inositolphosphatekinase1，IPK1)基因的修饰，使其对除草剂的耐性增强，在发育的种子中肌醇磷酸盐表达谱也发生了与预期一样的改变。Townsend等以烟草中的丙酮醇合酶(acetolactatesynthase)基因SuR

(SuRA和SuRB)位点为靶标，育成了对咪唑啉酮(imidazolinone)除草剂和对磺脲(sulphonylurea)除草剂都有抵抗力的新品种。当前第35页\共有40页\编于星期日\21点基因编辑的不足基因编辑是一项新技术，还存在构建复杂和价格的问题，其脱靶效应