蛋白质组学硕士

主要内容基因组学蛋白质组学的研究差异(比较)蛋白质组学研究

生物信息学当前第1页\共有71页\编于星期六\11点

一、基因组学及其研究内容▲1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构,标志分子生物学的诞生。▲基因组（genome）是指一个细胞或病毒包含的全部遗传信息的总和。

DNA:

遗传物质双螺旋结构基因（Gene）：具有遗传效应的DNA分子片段当前第2页\共有71页\编于星期六\11点基因组学(Genomics)：1986年美国科学家ThomasRoderick提出了基因组学指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。当前第3页\共有71页\编于星期六\11点人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP)？当前第4页\共有71页\编于星期六\11点HGP的最初目标通过国际合作，用15年时间(1990～2005)至少投入30亿美元，构建详细的人类基因组遗传图和物理图，确定人类DNA的全部核苷酸序列，定位约10万基因，并对其它生物进行类似研究。4张图：

HGP的终极目标阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息的数据库；开发数据分析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会问题。遗传图物理图序列图转录图当前第5页\共有71页\编于星期六\11点HGP的历史回顾1984.12犹他州阿尔塔组织会议，初步研讨测定人类整个基因组DNA序列的意义1985Dulbecco在《Science》撰文“肿瘤研究的转折点:人类基因组的测序”美国能源部(DOE)提出“人类基因组计划”草案1987

美国能源部和国家卫生研究院（NIH）联合为“人类基因组计划”下拨启动经费约550万美元1989

美国成立“国家人类基因组研究中心”，Watson担任第一任主任1990.10

经美国国会批准，人类基因组计划正式启动JamesWatsonWalterGilbert当前第6页\共有71页\编于星期六\11点第一个自由生物体流感嗜血菌(H.inf)的全基因组测序完成1996完成人类基因组计划的遗传作图启动模式生物基因组计划H.inf全基因组Saccharomycescerevisiae酿酒酵母Caenorhabditiselegans秀丽线虫当前第7页\共有71页\编于星期六\11点1997大肠杆菌(E.coli)全基因组测序完成1998完成人类基因组计划的物理作图开始人类基因组的大规模测序

Celera公司加入，与公共领域竞争启动水稻基因组计划1999.7第5届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度大肠杆菌及其全基因组水稻基因组计划当前第8页\共有71页\编于星期六\11点1999.7

第5届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度2000Celera公司宣布完成果蝇基因组测序国际公共领域宣布完成第一个植物基因组——拟南芥全基因组的测序工作

公共领域和Celera公司同时宣布完成人类基因组工作草图《Nature》刊文发表国际公共领域结果《Science》刊文发表Celera公司及其合作者结果Drosophilamelanogaster果蝇Arabidopsisthaliana拟南芥当前第9页\共有71页\编于星期六\11点2001年2月15日《Nature》封面2001年2月16日《Science》封面当前第10页\共有71页\编于星期六\11点2001年8月26日人类基因组“中国卷”的绘制工作宣告完成。2002年水稻、小鼠、疟原虫等基因组测序完成2003年4月14日中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。2003年10月，2004年10月人类基因组完成图公布。当前第11页\共有71页\编于星期六\11点人类基因组计划的实施意义

人类基因组计划为我们研究生物信息的组织、结构、遗传、表达带来了极大的方便，使人类对自身有一个根本的了解。人类是最高级、最复杂、最重要的生物，如果搞清楚人类基因组，那么再研究其它的生物就容易得多。研究多种模式生物基因组将有助于研究地球生物的进化史。当前第12页\共有71页\编于星期六\11点

人类基因组研究的兴起标志着生命科学进入一个从总体、综合角度理解生命活动分子基础的新阶段。随着1990年人类基因组（HumanGenomeProject,HGP)的实施并取得巨大成就,研究重心从开始的揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。当前第13页\共有71页\编于星期六\11点基因组学领域的分类根据生物系统特征分类结构基因组学(Structuralgenomics)功能基因组学(Functionalgenomics)基因组图谱绘制、测序基因和基因组组织基因组调节网络结构蛋白质结构特征转录组学(Transcriptomics)蛋白质组学(Proteomics)代谢组学(Metabolomics)当前第14页\共有71页\编于星期六\11点结构基因组学（Structuralgenomics）基因、蛋白质和其它生物大分子的全基因组（genome-wide）结构研究，包括基因组图谱绘制、基因组测序、基因组组织、以及蛋白质结构描述。关键问题1：基因组数据分析的算法和工具。全基因组测序和基因组注释仍然是结构基因组学的关键，基因组序列提供了基因组组织和结构的重要信息；关键问题2：基因组结构的破坏和控制。通过关闭基因功能或改变表达模式来检测；关键问题3：蛋白质结构测定和预测。实验方法（蛋白质表达和结晶、X射线晶体分析、NMR等）与计算方法（统计分析、建模、蛋白质结构预测）相结合。当前第15页\共有71页\编于星期六\11点功能基因组学（Functionalgenomics）基于全基因组（genome-wide）在系统水平上对生物系统功能各方面的研究，包括基因功能、调节网络。功能基因组学的特征是将大规模的实验方法与统计分析、数学建模和实验结果分析结合起来。全面认识和理解基因功能特征必须在RNA、蛋白质和代谢物水平上进行功能分析。

功能基因组学(Functionalgenomics)转录组学(Transcriptomics)蛋白质组学(Proteomics)代谢组学(Metabolomics)当前第16页\共有71页\编于星期六\11点转录组学（Transcriptomics）转录组（transcriptome）：细胞中所能转录得到的全部mRNA的集合转录组学：通过高通量方法研究转录物组的表达动力学（发生和变化规律）基因在mRNA水平上的变化与蛋白相关，研究mRNA表达模式对阐明未知基因的功能、调节途径和蛋白质网络等具有重要的意义转录组不是细胞的功能执行实体，转录组分析只能间接探讨基因的功能当前第17页\共有71页\编于星期六\11点代谢组学（Metabolomics）代谢组（metabolome）：指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物（如metabolicintermediates,hormonesandothersignalingmolecules,andsecondarymetabolites）。代谢组学：大规模研究代谢组的动力学和相互作用。代谢组分析提供了有关基因功能的重要信息。与转录组、蛋白质组相比，代谢物的数量远少于基因或蛋白的数量，因此代谢组分析相对简单。当前第18页\共有71页\编于星期六\11点蛋白质组学（Proteomics）蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出的。蛋白质组（proteome）：一个基因组编码的全套蛋白质集合，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：通过直接测定和鉴别蛋白质的高通量方法，大规模地研究蛋白质组的表达动力学和蛋白质相互作用。蛋白质表达动力学和蛋白质相互作用的研究是基因功能研究的重要途径。主要包括三个领域：－蛋白质鉴定和分析－基于蛋白质组水平（proteome-wide）的比较研究－蛋白质-蛋白质相互作用当前第19页\共有71页\编于星期六\11点

蛋白质组学研究的意义

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。虽有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的分析策略都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提认为细胞中mRNA水平反映了蛋白质表达水平。但事实并不完全如此，从DNA

mRNA

蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional

control

)，翻译水平调控(Translational

control)，翻译后水平调控(Post-translational

control

)。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。当前第20页\共有71页\编于星期六\11点

蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。

国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心(

APAF

)。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human

Proteome

Organization,

HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划。当前第21页\共有71页\编于星期六\11点二、蛋白质组学研究蛋白质组：是指一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表

达

的全部蛋白质。功能蛋白组：特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表

的蛋白质。蛋白质组学：是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研

究以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质

的组成及其动态变化规律的科学。内容包括鉴定蛋

白质表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相

互作用方式等。当前第22页\共有71页\编于星期六\11点蛋白质组与基因组的区别？1）蛋白质组的组成远比基因组庞大和复杂分子生物学发展初期的一个知名的信条是“一个基因一个蛋白质”。但后来已证实这是不确的,1个基因可以生产出多于1个蛋白质。越是高等的细胞,这种数量上的差异越明显。●据估计,在E.coli1个基因可编码1.3个蛋白;人的1个基因大约可编码10种蛋白。这是由于1个基因可经过基因内重组或在转录中经过不同的剪接翻译成不同的蛋白质,而蛋白质在合成之后又可能进行不同的翻译后修饰,包括磷酸化、糖基化、硫基化、酰基化、甲基化等。人类基因组的基因可能生产出几十万个蛋白.仅从这一个角度也可以看出,即使我们对基因组全部读出,仍然不足以对全部蛋白质的种类和数量加以描述和预测,更不足以对主要由蛋白质演绎的复杂生命活动加以描述和预测了。当前第23页\共有71页\编于星期六\11点2）蛋白质具有相对独立的代谢过程，由DNA编码合成的蛋白质,在其运输、装配方式、降解时间和途径等方面对编码它的DNA具有相对的独立性.例如,在细胞周期调控中cyclinB在G1晚期开始表达并逐渐积累,到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期中期阶段,然后特异性地迅速降解。目前已知的所有细胞周期调控蛋白及其他许多蛋白都具有各自严格的代谢途径和“生命”周期。3）蛋白质具有对生物机体内部及外界因素产生反应的能力在细胞增殖、分化、衰老和凋亡等重大生命活动中,蛋白质不仅具有表达时间、表达量的差异,而且具有对外界的环境刺激,包括生理信号、病理信号及外界物理、化学因素等刺激,能动地产生反应的能力,这是生命现象区别于非生命现象的基本特征之一。当前第24页\共有71页\编于星期六\11点4）蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用在很大程度上我们可以说“没有一个蛋白质是单独发挥其生物学作用的”,它需要与其他的分子相互作用才能完成其复杂的生理功能.蛋白质之间的相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应,它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络。蛋白质组学从多方位、多角度去研究蛋白质之间的相互作用和相互调控。相对来说,基因之间并不发生这种直接的相互作用.因此,只有通过对所有蛋白质的总和进行研究,即开展蛋白质组学研究,才能更加贴近地掌握生命的现象和本质,找到生命活动的规律。当前第25页\共有71页\编于星期六\11点蛋白质组学的研究内容总体分为两个方面：1．蛋白质表达模式（或蛋白质组成）研究。

各种细胞或组织全部蛋白质的表征

生理条件下蛋白质图谱和数据库

变化条件下蛋白质组发生的变化

发现和鉴定特定功能的一群蛋白质。2．蛋白质功能模式（目前集中在蛋白质相互作用网络关系）研究。

蛋白质的相互作用和相互协调是细胞进行信号传导及一切代谢活动的基础，蛋白质结构是发挥功能所依赖的基础。当前第26页\共有71页\编于星期六\11点蛋白质组学具体研究内容：1）蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等

技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀

等技术对蛋白质进行研究。蛋白芯片技术的基本原理：是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。当前第27页\共有71页\编于星期六\11点2）翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。当前第28页\共有71页\编于星期六\11点3）蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。4）医学医药的应用：蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康。如寻找药物的靶分子，很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。当前第29页\共有71页\编于星期六\11点5）在信号转导研究中的应用生物体能通过对外界环境因素的变化作出反应，主要靠复杂的调控基质调节，其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的，而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构的化学修饰来实现的，如磷酸化、糖基化、酰基化和遍在蛋白化等。蛋白质磷酸化/去磷酸化是蛋白质饭以后修饰中最普遍、最重要的形式。细胞内全部蛋白质的大约1/3在某一时间点磷酸化，并且主要是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化。以及大约5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶，可见，蛋白质修饰（磷酸化）在细胞生命活动中的重要性。它是环境因子刺激或介导的信号从胞外流向保内并导致细胞效应过程中的关键调节机制。因此，研究信号传导通路中的蛋白质分子的磷酸化或去磷酸化，已成为信号传导通路领域的前沿和热点。但由于磷酸化蛋白质大多数为低丰度蛋白质，用常规的2D分离技术很难分离得到。因此，富集磷酸化蛋白显得特别重要。当前第30页\共有71页\编于星期六\11点a.研究信号转导中蛋白质的翻译后修饰针对蛋白质翻译后修饰主要为磷酸化，并且主要为丝/苏氨酸和酪氨酸磷酸化的特点，对外界因素（如：EGF、PDGF）刺激细胞的前后的细胞提取物，使用泛抗磷酸化丝/苏氨酸抗体或/和泛抗磷酸化酪氨酸抗体，特异性沉淀丝/苏氨酸或/和酪氨酸磷酸化蛋白分子，然后进行二维电泳或一维凝胶电泳分离，比较刺激前后的图谱，从而可以获得差异蛋白质点，再用质谱技术进行鉴定，最终可以获得刺激因子（如：EGF）介导的信号转到通路中的信号分子的磷酸化改变，即信号分子是否活化，这有助于获得某因子激活的信号分子和由此建立由其介导的信号转导通路。可见，采用免疫共沉淀结合蛋白质组学高通量技术，有希望发现信号转导通路中的新的信号分子。当前第31页\共有71页\编于星期六\11点b.研究信号转导中蛋白质的相互作用

信号转导通路是一连串的生化和分子事件，其中的信号转导分子的抑制或加强，均将影响下游蛋白质分子的活性或导致下游靶基因的表达改变，可以从中发信号转导通路中的下游分子，Lewis等结合功能蛋白质组学和ERK1/2的选择性活化或抑制以寻求MKK/ERK通路的稀有效应分子，发现25种MAPK通路下游效应靶蛋白分子，仅5种蛋白质为以前知道的MAPK信号转导通路相关的蛋白质。c.研究信号转导中下游靶分子的研究应用范围:1）蛋白质，如蛋白质差异显示、蛋白质组作图和成分鉴定2）基因，如功能基因组计划、基因产物识别、功能鉴定和调控机制分析等3）重要生命活动的分子机制，包括细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展等4）医药靶分子寻找与分析当前第32页\共有71页\编于星期六\11点研究技术：双向凝胶电泳(2-DGE)和质谱(MS)是主要的技术:

蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。

二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。当前第33页\共有71页\编于星期六\11点

胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。当前第34页\共有71页\编于星期六\11点▲关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。▲蛋白质组研究技术体系包括：�样品制备；�双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional

polyacrylamidegelelectrophoresis,2-DPAGE)；�蛋白质的染色；�凝胶图像分析；�蛋白质分析；�蛋白质组数据库。当前第35页\共有71页\编于星期六\11点其中三大关键：①双向凝胶电泳技术

②质谱鉴定质谱分析原理图③计算机图像数据处理与蛋白质数据库当前第36页\共有71页\编于星期六\11点质谱分析仪当前第37页\共有71页\编于星期六\11点

原核及简单真核生物的蛋白质组研究

流感嗜血杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌的蛋白质组研究

致病微生物的蛋白质组研究

酿酒酵母的蛋白质组研究

当前第38页\共有71页\编于星期六\11点

流感嗜血杆菌的蛋白质组研究

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)是第一个获得基因组全序列的生物.瑞士的一个小组通过2-DPAGE研究了流感嗜血杆菌的蛋白质组分,在ｐＨ3-10的范围内鉴定了约300个蛋白质组分,然后用有两个尿素浓度的麦黄酮(tricine)胶分离了很难分离到的5-20ku范围内的蛋白质,还鉴定了其中的80种.另外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后,在ｐＨ6-11的范围内又鉴定了102个蛋白质,其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白.华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌303个蛋白质斑点进行质谱分析,确定了263个蛋白质,其中大部分是外膜蛋白,以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质.另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质.令人惊奇的是,大约22%的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等电点与分子质量,显示它们可能经过了翻译后加工.当前第39页\共有71页\编于星期六\11点大肠杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌全部4000多个基因的ＤＮＡ序列已被测定,人们想到如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联合起来,就会得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白质基因联合数据库,希望籍此来回答以下几方面的问题:ａ所有编码基因的产物在双向图谱上的位置,ｂ各种蛋白质的丰度,ｃ不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化,ｄ各种蛋白质在细胞内的定位,ｅ某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平.目前,大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版,大约包括1600个蛋白质斑点的数据,其中大约400个蛋白质斑点已与大约350个基因相对应(有些基因可能有多个蛋白质产物),对于这些蛋白质,这个数据库可以提供基因名称、蛋白质名称、EC编号、功能范畴、Swiss-prot数据库编号、Ｇenbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及一些生理信息(如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度).

当前第40页\共有71页\编于星期六\11点致病微生物的蛋白质组研究

蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研究上.当今,细菌对大多数抗生素都有了抗性,寻找作用于细菌内新靶子的研究工作已经展开,找到了许多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及其作用机理.有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失活,但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然未知,现在双向电泳分析提供了一个有效手段.例如在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时,对12种作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察,发现其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质,另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质,因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应,并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核糖体水平上.蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下蛋白质谱的变化.例如作为一种差异显示技术,这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的不同,结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平上有很大差别,这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会出现失败的现象

当前第41页\共有71页\编于星期六\11点酿酒酵母的蛋白质组研究

利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早于蛋白质组概念的提出.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组的完成及其蛋白质数据库在互联网上的建立,大大加速了这一工作.最新版的数据库包括6000多页,每页代表一个已知或推测的酵母蛋白.它包含以下几方面的信息:ａ以序列为基础的已知和推测的酵母蛋白的特征信息,如分子质量、等电点、氨基酸组成、多肽片段大小等;ｂ一些研究得到的关于各种蛋白质在翻译后加工、亚细胞定位、功能分类方面的信息;ｃ从以往的超过5000篇关于酵母蛋白研究的文章中获得的有关各种蛋白质功能、相互作用、突变表型的信息.借助数据库的有力推动,在双向电泳蛋白质谱上最明显的蛋白质斑点的大部分得到鉴定.当前第42页\共有71页\编于星期六\11点

正在丹麦进行的一项研究计划分别作出野生型和将基因系统缺失的缺陷型酵母的双向蛋白质图谱.初步的研究表明,缺失单一基因将导致的结果并不只是缺乏此基因编码的蛋白质,而是能导致其他一系列蛋白质量的改变.一些蛋白质减少而另一些蛋白质增多,当然还有一些蛋白质被加工修饰而导致性状改变.单一基因缺失的结果总是引起蛋白质组全局性的变化.大约20%的酵母基因缺失是致死性的,另外80%则不然,这时机体能通过调节蛋白质的表达来对抗这种内源性的变化.这种基因缺失的研究可能会告诉我们一些关于细胞内蛋白质分子间相互“对话”和“作用”的重要信息,如蛋白质间的物理联系(这些蛋白质可能会组成蛋白质复合物)、信号传递途径,以帮助我们了解细胞是如何构成的以及是如何协同工作的。当前第43页\共有71页\编于星期六\11点

多细胞真核生物的蛋白质组研究

线虫的蛋白质组研究

果蝇的蛋白质组研究人类的蛋白质组研究

植物的蛋白质组研究当前第44页\共有71页\编于星期六\11点线虫的蛋白质组研究利用双向电泳技术,Ｂini对线虫(Ｃ.elegans)进行了蛋白质组分析,在等电点3.5-9和分子质量10-200kｕ的范围内可分辨2000个以上的蛋白质斑点,然后利用Ｅｄｍａｎ微量测序技术对其中24个斑点进行分析,得到其中12个蛋白质的Ｎ端序列.其余的由于Ｎ端封闭而未能测出序列.已测出的12个中有1个未能找到与其匹配的基因.另外11个与能量代谢、酸性核蛋白、Ｇ蛋白等对应.Ｃ.elegans的19000个基因已于1998年12月全部测出,预计会对蛋白质组的研究提供帮助当前第45页\共有71页\编于星期六\11点果蝇的蛋白质组研究

不同性别果蝇(Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ)成虫的头、胸、腹部的蛋白质组图谱已被分别作出,总共约有1200个蛋白质被检出,其中的大多数在头、胸、腹中是相同的,但也发现了一部分其部位、性别特异的蛋白质.当前第46页\共有71页\编于星期六\11点人类的蛋白质组研究人的各种体液(血液、淋巴、脊髓、乳汁和尿等)都被用于研究与某些疾病的关系.最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究眼泪中的蛋白质与生理状态的关系.他们发现了一种新的蛋白质,这个蛋白质非常相似于在乳腺癌细胞里高表达的另一种蛋白质.这个发现可能会提供疾病诊治的新的手段.在一项利用蛋白质组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发现,乙醇会改变血清蛋白糖基化作用,导致许多糖蛋白的糖基缺乏,如转铁蛋白。当前第47页\共有71页\编于星期六\11点

肿瘤至今仍是人类的一个顽敌.癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物,而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平.肿瘤的蛋白质组研究能提供一些以往其他技术所不能提供的早期诊断依据,例如利用不同细胞组织的特征蛋白质谱,可以判别一些难以判定来源的肿瘤细胞的来源.丹麦的一个小组利用蛋白质组研究技术结合组织冰冻切片技术分析了150例膀胱癌病人的组织,发现在所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化学引诱剂———银屑素(ｐｓｏｒｉａｓｉｎ),推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物.

当前第48页\共有71页\编于星期六\11点三、差异蛋白质组研究蛋白质组学研究的途径：1)建立蛋白质组学数据库像基因组学的研究一样,力图“查清”人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质,建立蛋白质组学数据库。基因组研究的发端和升温,是由于大规模基因组测序技术的实现和其后高通量的基因芯片技术的发展所推动的.而蛋白质组迄今还不具有相应的技术基础,且DNA大规模的高通量研究是建立在4种碱基及其配对性质的相对单一和简单的原则基础上的,而对蛋白质的识别和鉴定的原则要复杂得多。随着对蛋白质组学的深入理解和具体工作的开展,人们逐渐认识到在短时间内建立人类蛋白质组学“完整的”数据库和实现网络资源共享是难以实现的,或者说条件尚未成熟.在没有弄清楚具体蛋白质的结构、功能、表达亚细胞定位之前,其应用前景也不是十分的明确和直接。当前第49页\共有71页\编于星期六\11点2)差异蛋白质谱是着重寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱,揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径,以及细胞调控机制,同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析,特点如下：1.差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的可实现性●目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术,例如双向电泳、质谱。双向电泳虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术,并在技术上已有了很大的改进,使其重复性和灵敏度大大提高,但它无法检测疏水性蛋白、极端pH的酸性蛋白和碱性蛋白以及某些低丰度蛋白,因此远不能捕获细胞内的全部蛋白质。●质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点,但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化,因而无法实现高通量的蛋白质分析。

此外,质谱是通过分子的飞行时间和带电荷多少来计算分子的分子质量的,因而它无法区分分子和带电荷相同的同分异构体的质量.上述这些技术的不完善都使得蛋白质组学的研究在当前还难以大规模地迅速开展。当前第50页\共有71页\编于星期六\11点●另一方面差异蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白,而重在找出有意义的差异蛋白,因而有着高得多的可实现性。双向电泳在差异蛋白质组分析中如同在“完全”蛋白质分析中一样,仍然是一项重要的技术,适用于差异蛋白质的检出。基质辅助激光解析离子化系统SELDI集分离纯化和质谱检测于一身,虽然它不具有分辨率和灵敏度方面的特别优势,但它可以直接检测相对原始的生物样品,并可同时进行多样品、多蛋白的检测,从而提供了适合于差异蛋白质组学研究的可比较性系统。

此外,一些新的方法如稳定同位素标记技术等正在迅速发展,它们使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高了,这将会有力地促进差异蛋白质组学研究的进展。当前第51页\共有71页\编于星期六\11点2.差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质●一个生物体在经历生长、发育及各种生理过程,甚至病理过程中,其基因组通常是始终维持稳定不变的,也即它可能表达的全部蛋白质的总和也是不变的,而其蛋白质组的构成却在随时发生着严格而活跃的改变。实际上几乎没有任何一种细胞在任何一个时刻是表达“所有”蛋白质的.例如人类细胞大约有290种左右分化的细胞,在每个细胞中约只有10000种蛋白质。而每个细胞在它不同功能状态、细胞周期不同时相、接受不同条件因素刺激或药物作用下,其蛋白质组也会发生相应的变化。●正是这种不同的蛋白质组构成了这一细胞这一时刻的特征性生命活动的基础因此,对于这种蛋白质组的特有组成及其改变的研究,即差异蛋白质组研究,是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径。当前第52页\共有71页\编于星期六\11点3.差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景●一个细胞的生命活动,基本上说就是构成其相应蛋白质组的蛋白质的相互装配及相互反应的表现和结果。只要能够获得它们在蛋白质组上的差别或变化的足够信息,就能够指证这个细胞或生物体所处的状态,以及它们的状态是正常或是异常,甚至常常可能找到其异常的原因。因此,差异蛋白质组学的研究在疾病的早期诊断、病程及疗效监测、环境因素影响分析等方面具有很好的应用值。目前对疾病特别是肿瘤的早期标志蛋白分子biomarker的筛选已在世界范围内形成热潮.以这类标志分子主要是蛋白质为依据的分子诊断技术将形成未来临床诊断的主流,而这又会有力地促进网络辅助医疗诊断的发展,使整个医疗事业的面貌发生巨大的变化。例如此外,在农业育种、基因工程产物的鉴定、食品蛋白质评价等方面,差异蛋白质组学也有着广泛的应用前景.这除了样品的选取不同外,在研究方法上与上述的biomarker筛选并没有什么不同。当前第53页\共有71页\编于星期六\11点差异蛋白质组学的研究方法:●双向电泳

双向电泳仍是目前可以覆盖最多蛋白质的技术,因此也仍是差异蛋白质组学研究的重要手段之一。●用于蛋白质定量和比较研究的质谱相关技术

质谱具有高敏感性、高分辨率,是迄今为止进行蛋白质定性研究不可缺少的工具.但由于通常要使用提纯的样品,所以被认为不适用于蛋白质之间比较,特别是定量比较的研究。近期发展一些新的方法，例如用引入稳定同位素标记分子的方法ICAT等技术将可能使质谱成为差异蛋白质组学研究的有力工具。●SELDI蛋白质芯片技术它具有快速、操作简便、样品用量少和对多样品的平行检测等特点。特别是它可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等。

当前第54页\共有71页\编于星期六\11点★总之,差异蛋白质组学的研究并不代替“完全”蛋白质组学的研究。而且它的研究结果可以大大丰富和促进“完全”蛋白质组学的建档和研究工作。但即使“完全”蛋白质组学研究取得了一定成果或已初步完成,差异蛋白质组学的研究将仍然具有其相对独立的价值和实际意义。当前第55页\共有71页\编于星期六\11点

四、生物信息学

当前第56页\共有71页\编于星期六\11点生物信息学是以生物大分子为研究对象,以计算机为工具,运用数学和信息系学的观点,理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。研究重点体现在基因组学和蛋白质两个方面。首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子量物质,以计算机为工具,研究各种学科交叉的生物信息学的研究方法,找出其规律性,进而发展出适合它的各种软件,对逐步增长的DNA和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、发布、提取、加工、分析和发现。由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。当前第57页\共有71页\编于星期六\11点建立分子生物信息数据库的流程图当前第58页\共有71页\编于星期六\11点一级数据库世界三大核酸序列数据库(公共序列数据库，PublicSequenceDatabase)

GenBank（美国）

EMBL(欧洲)

DDBJ(日本)A)核酸(DNA)序列数据库当前第59页\共有71页\编于星期六\11点

来源于人类基因组计划及各种模式生物基因组计划

1977年，最早获得的生物基因组全序列是噬菌体(53kb)1995年，第一个自由生物体流感嗜血菌(H.inf)被完全测序B)基因组数据库当前第60页\共有71页\编于星期六\11点部分生物基因组计划网址

老鼠(Mouse) 小鼠(Rat) http://ratmap.gen.gu.se

狗(Dog) 牛(Cow) 猪(Pig) 羊(Sheep) http://dirk.invermay.cri.nz

鸡(Chicken)

斑马鱼(Zebrafish)

线虫(C.elegans)

果蝇(Drosophila)

蚊子(Mosquito)

拟南芥(Arabidopsis)棉花(Cotton)

玉米(Maize)

水稻(Rice) http://www.staff.or.jp

大豆(Soya) :8000/main.html

树(Trees)

当前第61页\共有71页\编于星期六\11点

SWISS－PROT1.日内瓦大学医学生物化学系和欧洲生物信息学研究所(EBI)合作维护（1986年）；

2.在EMBL和GenBank数据库上均建立了镜像站点;3.数据库包括了从EMBL翻译而来的蛋白质序列，这些序列经过检验和注释；

4.数据记录包括两部分：序列注释(结构域、功能位点、跨膜区域、二硫键位置、翻译后的修饰、突变体等)5.数据存在滞后性TrEMBL数据库的建立C)蛋白质序列数据库当前第62页\共有71页\编于星期六\11点

PIR(proteininformationresource)1.由美国NCBI翻译自GenBank的DNA序列(1984年)；

2.在EMBL和GenBank数据库上均建立了镜像站点；

3.数据依据注释的质量分为4类。

分类名称(Name)说明(Comment)记录数(Numberofentries)PIR1已分类、已注释(Classifiedandannotated)13572PIR2已注释(Annotate