第12章 DNA的生物合成

第12章DNA的生物合成DNABiosynthesis*1*2第5节DNA损伤（突变）与修复第4节反转录和其他复制方式第3节DNA复制的基本过程第2节DNA复制的酶学和拓扑学变化第1节DNA复制的基本规律第12章DNA的生物合成

1865年，奥地利生物学家孟德尔(Mendel)总结8年的豌豆杂交实验提出：“hereditaryfactor(遗传因子)”决定生物性状、分离定律和自由组合定律。1910年，美国生物学家摩尔根(Morgan)对果蝇进行系统研究，提出基因在染色体上直线排列、连锁遗传和连锁交换定律。1933年获诺贝尔奖。1909年，丹麦生物学家约翰逊(Johannsen)进行了６年的菜豆自交与纯系实验；据希腊文“给予生命”之义，最先用“基因”替代了“遗传因子”。*31.基因概念的提出和发展

1928年格里非斯(Griffith)，1944年艾弗里(Avery)的肺炎双球菌遗传转化实验，证实了遗传物质是DNA而不是蛋白质。*42.遗传物质化学本质的探索

1952年赫尔希(Hershey)和沙斯(Chase)的T2噬菌体侵染细菌实验进一步证明携带遗传信息的是DNA。与德尔布吕克(Delbrück)和鲁利亚(Luria)同获1969诺贝尔生理医学奖。

1951年，鲍林(Pauling)，威尔金斯(Wilkins)和富兰克林(Franklin)用X线晶体衍射技术发现了蛋白质α双链螺旋结构。FranklinDNAX射线衍射图谱即将面世。1952年，查戈夫(Chargaff)等用层析和紫外光谱分析技术发现：①A=T，G=C；

②不同种属DNA的4种碱基组成不同；

③同一种属不同组织的DNA碱基组成相同。

1953年4月，Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，《Nature》杂志上发表。同一杂志上还发表了Franklin的DNAX射线衍射图谱，及Wilkins的DNAX射线衍射分析数据。

*63.DNA分子的双螺旋结构模型提出DNARNAProtein中心法则TheCentralDogma1958F.Crick翻译转录反转录复制复制中心法则的补充：①1965年发现RNA复制②1970年发现逆转录酶*74.中心法则的提出和发展复制的基本规律第一节BasicRulesofDNAReplication*8学习要求：

掌握复制及其基本规律、半保留复制、双向复制、半不连续性复制、复制叉、复制子、领头链、随从链、冈崎片段的概念。

熟悉半保留复制的实验依据。DNA复制的概念:复制亲代DNA子代DNA*9DNA复制是一个由多种酶催化，多种蛋白因子参与，并且受到精密调控的复杂过程。E.coli染色质的复制涉及约30种蛋白质。指遗传物质的传代，是以母链DNA为模板，按碱基配对的原则,合成两个完全相同的子链DNA分子的过程。复制的基本规律半保留复制

(semi-conservativereplication)双向复制

(bidirectionalreplication)半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)*10一、半保留复制DNA复制时，母链DNA解开成两股单链作为模板，按碱基配对规律合成与模板互补的子链；形成的2个子代DNA中，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成；2个子代DNA碱基序列都和亲代DNA的一致。Watson

andCrick,1953.亲代DNA子代DNA模板荣获1962年诺贝尔医学与生理学奖。图12-1DNA复制理论上有三种可能形式*121958,M.Mmlson

&F.W.Stahl设计的实验*131958,M.Messelson

&F.W.Stahl设计的实验*14按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。

半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。*15二、双向复制DNA复制从固定的复制起始点(origin，ori)开始，分别向两个方向进行解链、复制，称为双向复制。复制叉复制叉5’3’5’5’3’3’5’3’3’5’原核DNA：单点双向复制*16ori是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。共同特征：这些短重复序列被多亚基的复制起始因子(DnaA；RC:originrecognitioncomplex)所识别并结合；一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋解链产生单链

DNA。①由多个独特的短重复序列组成；E.Coli的称oriC，由245bp的保守序列和控制元件组成；酵母的称自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence,ARS),含含11bp富含AT的核心序列。*175’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’真核DNA：多点双向复制复制子长度两个相邻复制起始点之间的距离定为一个复制子长度。*18复制子(replicon)：独立完成复制的功能单位。

三、复制的半不连续性35353´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)3´5´3´5´*19

半不连续性复制过程中，领头链连续复制，而随从链不连续复制的现象。冈崎片段(okazakifragment)

指不连续复制的片段原核:1000~2000个核苷酸（nt）

(相当于1个顺反子，即基因的大小)

真核:100~200个核苷酸（nt）(相当于1个核小体DNA的大小)*20DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyofDNAReplication*21学习要求：

掌握参与DNA复制的主要物质种类，原核和真核生物DNA聚合酶作用、种类及特点，拓补异构酶、引物酶、单链DNA结合蛋白和DNA连接酶的作用和特点。

熟悉DNA复制的化学反应、保真性的酶学依据。

了解DNA聚合酶的分子结构特点，复制中DNA分子的拓补学变化。底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。参与DNA复制的物质:*22一、复制的化学反应

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPiDNApol只可沿5→3方向延长；需模板和引物；聚合反应特点：消耗2个高能磷酸键。活性：1.53

聚合酶活性，需要引物；

2.35核酸外切酶活性。二、DNA聚合酶是指以DNA作为模板，催化底物dNTP合成DNA的一类酶。全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol*24DNA-pol的5´3´聚合作用3´5

53´3´5DNA-pol5

3´OHP*253´5´外切酶5´3´外切酶5´3´内切酶3´5´外切酶5´3´外切酶外切酶与内切酶作用图解*265´3´（一）原核生物的DNA聚合酶共同点：1.53

的聚合活性，需要引物；

2.35外切酶活性。DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ不同点：DNA-polⅠ还有53外切酶活性。*27DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ5′→3′多聚酶活性有有有3′→5′外切酶活性有有有5′→3′外切酶活性有无无聚合速度（核苷酸数/酶分子·分钟）60030约30000组成单体单体多亚基复合物分子数/细胞400？20分子量（kD）109120250基因突变后的致死性可能不可能可能功能切除引物、修复、填补空缺修复？复制大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能*28功能：对复制中的错误进行校读，对复制

和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ(109kD)*291959年诺贝尔生理学医学奖得主DNA-pol

I

5´3´外切酶活性的功能切除引物，切除突变片段5´3´*30DNA-pol

I

3´5´外切酶活性的功能校读（proofread）功能5´3´GC将错配的核苷酸从引物链的3′端除去

*31323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸

5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性N端C端枯草杆菌蛋白酶DNA-polⅠ酶切片段Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

*32DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活；对模板的特异性不高；它参与DNA损伤的应急状态修复。

*33*是由A.Kornberg的二儿子TomB.Kornberg发现的。

DNA-polⅢ(含10多个亚基的异二聚体)核心酶:由α、ε、θ构成*34功能:原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ同时合成领头链和随从链*35聚合酶αβγδε定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性有有有有有3′→5′外切活性无无有有有持续合成能力中等低高有PCNA(β亚基)时高高功能起始引发，引物酶活性低保真度的复制线粒体DNA复制延长子链的主要酶，解旋酶活性填补空缺，切除修复，重组

（二）真核生物的DNA聚合酶*36三、复制的保真性(fidelity)

（1）严格按照碱基配对规律外进行复制，突变率约为1/103；

（2）DNA聚合酶对模板的依赖性和对碱基的选择，是子链与母链能准确配对(突变率1/104~5)，使遗传信息延续和传代的保证；

（4）DNA修复系统和复制起始必须利用引物等机制，使突变率由1/106~8降低到1/109~10

。

（3）DNA聚合酶3′→5′外切酶功能和5′→3′聚合酶活性实现的即时校读(proofread)，可使突变率由1/104~5降低到1/106~8；*37四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用；因此，DNA复制涉及DNA双螺旋构象变化及解链过程。*38

种类：解旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和rep蛋白解旋酶Ⅱ、Ⅲ：沿着随从链的模板，从5’→3’方向，促使复制叉向前延伸；rep蛋白(六聚体)：沿着领头链的模板，从3’→5’方向向前移动，促使双链不断解开；（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白解螺旋酶(helicase)又称解链酶，利用ATP供能，作用于氢键，使双螺旋DNA解旋和解链成为两条单链。*39解螺旋酶和单链DNA结合蛋白协同作用单链DNA结合蛋白

(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。*40（二）引物酶(primase)

所有细胞和多数病毒的DNA复制，都须首先利用DNA模板合成一段被称之为引物的，长度从几个到几十个核苷酸的，短链RNA序列，为DNA聚合酶提供游离3’-OH端合成DNA链。原核细胞的引物酶是一种仅用于DNA复制所需引

物合成的RNA聚合酶；

真核细胞的引物酶是DNA聚合酶α的两个小亚基。

G4噬菌体等利用宿主菌引物酶合成引物，M13噬菌体则利用细菌RNA聚合酶合成引物。*41

反转录病毒利用宿主细胞tRNA的3′-OH端

作为反转录引物；

线粒体DNA复制利用RNA聚合酶的转录产物3′-OH端作为引物；ΦX174噬菌体利用环形双链DNA中一条链的

切口处为DNA聚合酶提供游离3′-OH端。特殊形式的引物：2023/6/542*42

是一种可逆的核酸酶，它既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其重新连接；可快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。

（三）DNA拓扑异构酶

(DNAtopoisomerase,Topo)

*43*44

拓扑异构酶可快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：TopoⅠ、TopoⅡ和近期发现的TopoⅢ；TopoⅢ只消除负超螺旋，而且活性较弱。原核生物：TopoⅡ将前方的正超螺旋转变为负超螺旋；TopoⅠ使DNA变为松弛状态，与转录有关。真核生物：TopoⅠ和TopoⅡ都能清除前方的正超螺旋。作用：通过切断、旋转和再连接，理顺DNA链。

*45DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋DNA双螺旋正超螺旋原核TopoⅡ原核TopoⅠ真核TopoⅠ、ⅡDNA聚合酶*46切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。不需ATP，切割双链DNA中的一条链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ：

临床上使用的某些抗肿瘤药(如喜树碱、鬼臼乙叉甙等)可通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞。作用机制*47五、DNA连接酶(DNAligase)由RNaseH与DNA-polⅠ外切酶活性除去冈崎片段中的RNA引物，间隙由DNA-polⅠ填补成DNA，缺口由DNA连接酶催化相邻冈崎片段间的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯键而连成完整的DNA链。注意：只能连接碱基互补基础上双链中的单链缺口；而对单独存在的DNA单链或RNA单链没有连接的作用。AMP+PPi*48连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口*49

在复制中起最后接合缺口(双链中的单链

缺口)的作用；在DNA修复、重组及剪接过程中起缝合缺

口的作用；基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶功能*50

DNA复制因子和酶原核生物真核生物功能起始识别因子OriginRec.FactorDnaAHU(类组蛋白)ORC(6聚体)Cdc6、MCM识别、结合复制起始点解螺旋酶HelicaseDanB(6聚体)DnaC(6聚体)DNA-pol

解开DNA双螺旋链单链结合蛋白SingleStrandBPSSBSSB结合、稳定DNA单链拓扑酶Topoisomerase拓扑酶Ⅱ拓扑酶Ⅰ拓扑酶Ⅱ清除复制叉前方的超螺旋引物酶PrimaseDnaGDNA-pol

合成一小段RNA引物DNA聚合酶DNAPolymeraseDNA-PolⅠDNA-PolⅢβ亚基DNA-pol

DNA-pol

PCNA以亲代DNA单链为模板，按5′→3′方向延长子链DNARNA酶HRNaseHRNA酶HDNA-PolⅠRNA酶HRNaseH分解、清除引物连接酶Ligase连接酶连接酶连接DNA片段参与DNA复制的主要因子和酶*51DNA生物合成过程第三节TheProcessofDNAReplication*52学习要求：

掌握原核生物DNA复制过程和各阶段的特点；掌握端粒和端粒酶概念，

熟悉真核生物DNA复制过程和各阶段的特点；熟悉复制起始、引发体、负超螺旋等概念。

了解端粒延长机制。（一）复制的起始(initiation)一、原核生物的DNA生物合成

复制是一个连续的过程，根据复制的特点，人为分成起始、延长和终止三个阶段。引物合成DNA解链引发体生成1.DNA复制起始点的辨认结合与解链原核生物DNA的复制有一个特定的复制起始点；E.coli的复制起始点称为oriC，由245bp的保守序列和控制元件组成。*53上游有3组13bp串连重复序列能被DnaB(解螺旋酶)和DnaC蛋白识别结合下游有2对9bp反向重复序列能被DnaA蛋白(起始因子)识别结合复制起始辨认oriC并解链主要需要6种蛋白因子：DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(类组蛋白)、拓扑酶(即促旋酶)和SSB*54ArrangementofsequencesintheE.colireplicationorigin,oriC.*DUE:DNAunwindingelement.ModelforinitiationofreplicationattheE.coliorigin,oriC.EightDnaAproteinmolecules,eachwithaboundATP,bindattheRandIsitesintheorigin.引物3'HO5'3535引物酶HO3'5'引物酶DanC解螺旋酶SSB引物SSBHO3'(DnaB)(DnaG)(DnaG)引发体：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA复制起始区域的复合结构。引物：是由引物酶催化合成的短链RNA分子,能提

供3′-OH。

2.引发体的形成和引物*56（二）复制的延长(elongation)复制延长指在DNA-polⅢ催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

3——AAGACCTATTGCAAT--------—55——TTCTGGATAA-OH3*57领头链：合成一段RNA引物（比冈崎片段的引物略长），开始合成后通常一直继续下去。*58随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎

片段。*59领头链：合成一段RNA引物（比冈崎片段的引物略长），开始合成后通常一直继续下去。随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎

片段。*60在营养丰富培养基，E.Coli每20分钟即可分裂一次；其基因组碱基数为4.6×106bp,DNA为单点双向复制，可推算出复制速度约115kb/min(1,900bp/s)；真核染色体DNA为多点双向复制，复制叉移动速度约1～3kb/min(16~50bp/s)；复制子长度为100～200kb，约30～60分钟内完成复制(25~110bp/s)；完成染色体复制时间通常要用6～8小时。*611.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合点就是复制的终止点。（三）复制的终止oriter

E.coli8232SV40oriter500*622.终止区含有多个约22bp的终止子(termi-nator,ter),识别结合ter序列的是Tus蛋白。

Tus(terminusutilizationsubstance)蛋白具有反解旋酶活性，Tus-ter复合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止复制叉前进。

Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成复制体解体；解体后大约仍有10～100bp未被复制，这时通过修复方式填补空缺。*633.随从链上不连续性片段的连接*64WhenDNAreplicated,itsstrandsareseparatedbytheenzymehelicase.SinglestrandDNAbindingproteinkeepsthestrandfromre-annealing.OneDNAstrandwecalledtheleadingstrand,whichformfrom5primeto3primeend,usingDNApolymeraseIII,noproblemhere.Butthelaggingstrandpresentsproblem.Ithasformedfrom5primeto3primetoo.ItformspiecescalledOkazakifragments.FirstaRNAprimaselaysdowntheRNAprimer,thenDNApolymeraseIIIlaysdownnewDNA.theprocessrepeatsagainandagain.DNApolymeraseIreplacestheRNAprimerithDNA,finallyDNAligaselinkstheOkazakifragments.原核生物的DNA生物合成

*65二、真核生物的DNA生物合成

复制起始点多、冈畸片段短、复制叉前进速度慢等特点，最重要的是参与复制的酶种类、数量更多更复杂。细胞完成一轮分裂的过程称为细胞周期(cellcycle)，分为4期；在良好营养条件下培养细胞，历时约24小时。

复制仅发生在细胞分裂的合成期(S期)，而且只复制一次。*66（一）复制的起始（与原核生物比较）1、过程同原核生物：解链引发体形成生成引物2、特点：起始点称自主复制序列(autonomousreplicationsequence,ARS),结构较oriC短(酵母：为150bp

含有11bp富含AT的

核心序列的片段;

被ORC(originrecognitioncomplex)识别结合。多起点（多复制子）时序性（分组激活，非同步进行）*673、参与酶和蛋白因子：

DNA-pol（引物酶活性）

DNA-pol（解螺旋酶活性）拓扑异构酶复制因子(RF，如：RFA、RFC)

增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)4、通过细胞周期实现其调节：蛋白激酶磷酸化激活各种RF而调控细胞周期进入S期，相关cyclin和CDK相互作用，实现对DNA复制的多样化和精确的调节。

*68ARSARS：自主复制序列，为150bp含11bp富AT核心序列的片段。复制起始分两步：G1期，ORC对ARS的识别结合及前复制复合物(pre-RC)的形成：ORC识别结合ARS、Cdc6与ORC结合、MCM2~7成环状复合体，组装成pre-RC。S期，pre-RC磷酸化激活：

CDK使pre-RC磷酸化激活，复制起点DNA解旋、募集DNA聚合酶，起始复制。Cdc6:Celldivisioncycle6，细胞分裂周期蛋白6MCM:minchromosomemaitenanceproteins，小染色体维持蛋白领头链3535亲代DNA5335随从链（二）复制的延长DNA-polδ：在PCNA和RF-C协同下，替代DNA-polα继续催化领头链和随从链合成。DNA-polα：催化10个碱基引物和头20~30个碱基组成的DNA合成；*703`5`3`5`5`3`核小体引物注：当随从链延长了大致相当于一个或若干个核小

体的长度(135bp，或135bp的若干倍)就要重

新合成引物长度。*715’PHO3’P5’3’OHHO5’PP5’HO3’3’OHP5’5’P3’OH真核生物染色体DNA是线性结构，染色体两端新链的引物被去除后，分别留下一段空隙和一段单链DNA母链。

（三）复制终止和端粒酶引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol

）连接（连接酶）1、复制终止基本过程*72两端单链DNA母链不填补成双链，就会被核内DNase酶解，造成子代染色体末端缩短。某些低等生物出现少数特例，经多次复制后的染色体越来越短，造成末端相邻的一些重要基因丢失、遗传信息完整性破坏。*73端粒染色体端粒(telomere)是指真核生物染色体末端DNA与它的结合蛋白紧密结合而形成的特殊结构。端粒的功能：

☆稳定染色体末端结构；☆防止染色体间末端连接；☆补偿DNA5′末端在清除RNA引物后造成的空缺。*74端粒的结构特点TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒的共同结构是富含(TmGn)x重复序列，重复的次数由几十到数千不等，并能反折成二级结构。水解引物后每个染色体的3’末端比5’末端长,伸出约12～16个单核苷酸链，这一特殊结构可募集一种称为端粒酶(telomerase)的特殊酶。P5’HO3’3’OHP5’5’P3’OH*75

端粒酶(telomerase)人端粒酶组成(1997,成功克隆)功能特点由RNA和蛋白质组成，是一种特殊的反转录酶。☆端粒酶RNA(hTR,能与染色体的3’ssDNA互补)☆端粒酶协同蛋白1(hTP1)☆端粒酶逆转录酶(hTRT)

☆能够延伸其DNA底物的3’端；☆以自己的RNA组分作为模板，

以染色体3’端ssDNA作引物。*76

端粒酶催化作用的爬行模型G-C配对回折*77-OH-OH-OH

正常细胞：细胞分裂

衰老死亡

细胞年轻化细胞分裂

端粒酶抗衰老端粒、端粒酶与细胞衰老*78端粒、端粒酶与肿瘤但某些肿瘤形成时可产生端粒缺失、融合、或缩短等现象。☆癌细胞可通过某些机制启动端粒酶基因的表达，使染色体端粒稳定地维持一定的长度，使癌细胞得以持续增殖、转移并获得永生。大多数增殖活跃的肿瘤细胞（约85%）端粒酶活性增高。☆端粒酶可作为为病变组织良恶性鉴别指标，及抗癌治疗的靶位点。*79*80真核与原核生物复制的主要区别*81反转录和其他的复制方式第四节ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays*82学习要求：

掌握反转录概念、作用特点、作用过程及生物学意义。了解滚环复制和D环复制。逆转录酶(reversetranscriptase)RNA病毒逆转录(reversetranscription)现象RNADNA

逆转录酶又称反转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶(RNAdependentDNApolymerase,RDDP)。一、反转录酶和反转录

1.逆转录酶活性：以RNA为模板(tRNA为引物)合成DNA2.RNaseH活性：水解RNA-DNA杂合分子中的RNA3.DNA-pol活性：以DNA为模板合成DNA逆转录酶没有3′→5′外切酶活性,无校对功能。*83图12-18反转录酶催化RNA转变为双链cDNA的途径AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnARnaseHTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′B．试管内合成cDNA逆转录病毒的生活周期：进入宿主细胞

双链RNA

逆转录酶

双链cDNA(前病毒)

整合到宿主细胞基因组DNA中

宿主细胞RNA聚合酶II

mRNA

病毒RNA基因组合成病毒蛋白质包装成新的病毒颗粒，离开宿主*85*86反转录病毒细胞内的逆转录过程：受体:CD4辅受体：CCR5/RANTES

或CXCR4/SDF-1gp120二、逆转录研究的意义

（1）扩展了中心法则；表明RNA可同时兼有遗传信

息传代与表达的功能。（2）对反转录病毒的研究，有助于肿瘤和艾滋等疾

病发病机制和诊治的研究。（3）cDNA法、反转录病毒载体已成为基因工程和

基因治疗的重要工具。

1964~1970,Baltimore、Temin和Dulbecco在RSV和MLV研究，发现反转录酶、肿瘤病毒和细胞遗传物质间的相互作用，获1975诺贝尔生理/医学奖。*87AZT(3′叠氮-2′,3′双脱氧胸腺核苷)是已用于艾滋病临床治疗的抑制反转录酶的药物AZT经T淋巴细胞吸收后转变为AZT三磷酸酯。

一方面AZT三磷酸酯与HIV反转录酶有高亲和力，竞争性抑制了酶对dNTP的结合；

另一方面AZT可被加接到合成中的DNA链3′端，但AZT没有3′-OH，故病毒DNA合成被迅速终止。*882007年，艾滋病疫苗研究接连受挫：9月底，美国国立卫生研究院(NIH)在最后一刻决定：停止一项耗资达1.3亿美元的艾滋病疫苗试验。9月中旬，默克制药公司宣布，其耗时10年研制的艾滋病疫苗中期临床试验失败；默克的疫苗被认为是最有希望的艾滋病疫苗。2009年，艾滋病疫苗研究再现新希望：

2009，美国和泰国研究人员在泰国首都曼谷联合宣布,一种新型试验疫苗可使人体感染艾滋病病毒的风险降低31.2%。中国艾滋病疫苗类型：复制型多价活病毒重组疫苗疫苗载体：疫苗原毒株：HIV-1CRF-07株，中国流行最广毒株。可选用的重组DNA抗原成分：gag、pol、env和nef基因。

复制型天坛株痘苗病毒。是自1926年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒，经连续传代减毒而获得。一期临床实验：2005年3月12日开始，在广西进行，共有49名志愿者接受了疫苗的注射。二期临床实验：2009仍在广西进行，将有230名志愿者开展一系列实验研究。经过基因操作技术将4个毒力基因剔除，用4个HIV基因取代。研究进展：*90三、滚动复制和D环复制（自习）

某些低等生物中存在一种单向复制的特殊方式——滚环复制（rollingcirclereplication）。如ΦΧ174和M13噬菌体，爪蟾卵rDNA。*91

线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）采用另一种单向复制的特殊方式，称为D-环或取代环式（displacementloop）复制。*92第五节DNADamage(Mutation)andRepairDNA损伤(突变)与修复*93学习要求：

掌握DNA损伤(突变)的概念、突变的类型，切除修复的基本原理。熟悉突变的意义、引发因素，光修复、SOS修复及重组修复的概念。了解光修复、SOS修复及重组修复的机制。基因组DNA分子序列的异常变化，称为DNA突变(mutation)，或DNA损伤(DNAdamage)。一、突变的意义（1）突变是进化、分化的分子基础（2）突变导致基因基因多态性产生（3）突变是某些疾病的发病基础（4）突变可导致死亡*94①物理因素:

紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射。②化学因素：

化学诱变剂，大多数是致癌物。③生物诱变剂：*如可移动遗传因子，即能在基因组中移

动的DNA序列。

如：病毒(如逆转录病毒)二、引发突变的因素*95DNA分子上的碱基错配又称点突变(pointmutation)发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。颠换1.错配(mismatch)三、突变的分子改变类型*96镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-Val

·

His

·

Leu

·

Thr

·

Pro·Val

·

Glu

·

·

·

·

C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-Val

·His

·

Leu

·Thr

·

Pro·Glu

·

Glu

·

·

·

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C肽链CTCGAG基因*972.缺失、插入和框移突变缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移(frameshift)突变或称移码突变：是指读码框三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。*98谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突变*99由基因重排引起两种地中海贫血基因型3.重排(rearrangement)DNA分子内较大片段的交换，又称为重组或重排。*100四、DNA损伤的修复DNA修复(DNArepair)直接修复(directrepair)