肝胆生化及检测

第九章肝胆生化及检测第一节概述一、肝脏结构（一）解剖学特点双重血液供应腹主动脉的分技肝动脉氧门静脉营养双重输出管道肝静脉代谢降解物

下腔静脉胆道系统脂溶性物质及其代谢产物体外（二）肝脏的显微结构特点1、组织结构2、亚细胞结构（三

）细胞的再生二、肝脏的生物化学功能排泄功能物质代谢功能生物转化重要生化功能（一）排泄功能主要排泄对象：胆汁酸、胆红素、氨1、胆汁酸代谢（1）胆汁的分泌：胆汁功能：促进脂类的消化吸收，同时能将体内某些代谢产物及生物转化产物不断地排入肠道随粪便排出体外。胆汁的来源：肝胆汁胆囊胆汁十二指肠胆汁的成分：水/胆汁酸（盐）、卵磷脂、蛋白质、脂肪酸和胆固醇（2）胆汁酸生成及种类：初级胆汁酸（肝细胞）次级胆汁酸（肠道）初级游离胆汁酸初级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）次级游离胆汁酸次级结合胆汁酸（甘氨酸/牛磺酸）（3）胆汁酸肝肠循环：（4）胆汁酸的功能：①促进脂类消化②促进脂类吸收③抑制胆固醇从胆汁中析出沉淀游离型胆汁酸结合型胆汁酸2、胆红素代谢胆色素

尿胆素原粪胆素原尿胆素粪胆素胆绿素胆红素未结合胆红素(单核吞噬细胞系统如骨髓、脾脏)结合胆红素（肝脏）胆素原部位——肝脏细胞鸟氨酸瓜氨酸瓜氨酸精氨酸代琥珀酸ATPAMP+PPi延胡索酸鸟氨酸精氨酸H2O尿素天门冬氨酸NH3CO2氨甲酰磷酸+H2O尿素循环（二）物质代谢功能1、营养物质代谢2、激素及维生素代谢(1)在蛋白质代谢中的作用(2)在氨基酸代谢中的作用(3)在糖代谢中的作用(4)在脂代谢中的作用激素的灭活主要在肝脏进行多种维生素能在肝细胞内储存并进行转化三、肝脏疾病的生化改变（一）胆红素代谢障碍（黄疸）定义:黄疸分类:黄疸和阻塞性黄疸溶血性黄疸肝细胞性黄疸高胆红素血症（二）胆汁酸代谢障碍1、胆汁酸合成障碍2、胆汁酸向肠道排出障碍3．胆汁酸肠肝循环紊乱4．胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱（三）血浆酶异常1．肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2.肝细胞内酶:

ALT、AST

3．肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT4．肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（MAO）

（四）血浆蛋白异常第二节肝功能试验血清（浆）蛋白测定血清酶测定血清胆红素测定血清胆汁酸测定血氨测定血清酶测定（一）氨基转移酶测定1．赖氏法测定ALT（１）原理：

ALT催化丙氨酸(alamine)与α-酮戊二酸(α-oxoglutarate)之间的氨基转移反应，生成丙酮酸(pyruvate)和谷氨酸(glutamate)。

在37℃及pH7.4条件下反应30min，以2，4-二硝基苯肼终止反应，并与底物α-酮戊二酸和产物α-丙酮酸的羰基生成2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下生成红棕色，与505nm波长处读取吸光度后计算活性。（２）方法评价：①赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；②NaOH的浓度对显色有影响；③该法的重复性差。【参考范围】

5～25卡门氏单位【临床意义】(2)慢性活动性肝炎或脂肪肝：(1)肝细胞损伤的灵敏指标:ALT轻度增高(100～200IU),或属正常范围,2.连续监测法测定ALT（１）原理：

采用酶偶联反应,即L-丙氨酸和α-酮戊二酸在ALT作用下，生成丙酮酸和L-谷氨酸。丙酮酸再在LD作用下生成L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD+,可在340nm处连续监测到NADH的消耗量,从而计算出ALT活性浓度。

双试剂法

:首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5分钟，将标本中所含的α-酮酸(如丙酮酸)消耗完，然后，加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-△A/min)，来计算ALT的活性。（２）方法评价：①存在着两个副反应，会使测定结果偏高；A、血清中存在的α-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。B、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH。

②双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，是ALT测定的首选方法；③血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。3.赖氏法测定AST（１）原理：

血清中的AST可催化门冬氨酸(aspartate)与α-酮戊二酸间的氨基移换，生成草酸乙酸(oxaloacetate)和L-谷氨酸。草酸乙酸自行脱羧转变成为丙酮酸。反应60分钟后，加入2，4-二硝基苯肼终止反应，并与酮酸生反应生成两种2，4-二硝基苯腙。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在505nm处差异最大，由草酸乙酸转变成的丙酮酸所生成的苯腙呈色强度显著大于α-酮戊二酸苯腙。据此可用比色法测定AST活性。

（２）方法评价：①赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出；②该法的重复性差：负干扰现象【参考范围】

8～28卡门氏单位【临床意义】肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎：血清AST也可轻度增高。心肌梗死：血清中AST活性增高各种肝病病人：血清AST的升高4．连续监测法测定AST（１）原理：

采用酶偶联反应,即L-门冬氨酸和α-酮戊二酸在AST作用下，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶作用下生成L-苹果酸，同时伴有NADH转化为NAD+，在340nm监测NADH的转化速率，从而计算出AST的活性。

双试剂法

:同ＡＬＴ测定。（２）方法评价

误差可来自内源性和(或)外源性内源性干扰主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-谷氨酸脱氢酶(GLDH)。外源性干扰来自试剂中污染的GLDH和AST。

【参考范围】

5～40IU/L(连续监测法测定)

【临床意义】

见赖氏法(二)ALP测定化学法连续监测法：鲍氏法金氏法皮氏法１、金氏法测定ALP（１）原理：

ALP在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解释放出酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4－氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，根据红色深浅确定ALP的活力。(2)方法评价：

磷酸苯二钠比色法与更早的β-甘油磷酸钠法相比具有较大的优点，如水解速度快，保温时间较短、灵敏度较高、显色稳定、不需去蛋白、操作简单、快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低；操作比较繁琐,，灵敏度低。【参考范围】成人：3～13单位，儿童：5～28单位

ALP金氏单位定义是100ml血清，37℃与底物保温15分钟，产生1mg酚为1个金氏单位。ALP主要用于诊断肝胆和骨骼疾病【临床意义】2.连续监测法测定ALP（１）原理：以磷酸对硝基酚(p-nitrophenylphosphate,4-NPP)为底物，2-氨基-2-甲基-1,3-丙醇（2-amino-2-methyl-1-propanol,AMP）或二乙醇胺为磷酸基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，对硝基酚(p-nitrophenol，4-NP)在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。（１）方法评价：线性范围可达500U/L，批内CV为2.06%～2.36%，批间CV为2.74%。【参考范围】男性：1～12岁<500U/L,女性：1～12岁<500U/L

12～15岁<750U/L，>15岁40～150U/L，

>25岁40～150U/L。【临床意义】

见金氏法(三)GGT测定法化学法（重氮反应比色法）和连续监测法。1.重氮反应比色法测定GGT原理：

【参考范围】男性3～17U/L；女性2～13U/L2.连续监测法测定GGT(1)原理：

(2)方法评价：

(2)方法评价：重氮比色法活性单位：100ml血清在37℃下反应1hr,生成0.5μmol的α-苯胺为1个GGT活性单位。男性：11～50U/L；(以γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺为底物)女性：7～32U/L

男性：≤40U/L；女性：≤30U/L(以γ-谷氨酰-4-硝基苯胺为底物)【参考范围】(四)MAO测定原理:

MAO主要作用于CH2-NH2基团，在氧参与下，氧化脱氨生成相应的卞醛、氨及过氧化氢。以苄氨偶氮-β-萘酚为底物,在O2和H20参与下，MAO催化生成苄醛偶氮-β-萘酚、氨及过氧化氢，用环己烷抽提后进行比色测定。(2)方法评价：【单位定义】：

1ml血清与底物在37℃孵育60分钟，催化单胺氧化产生1nmol苄醛偶氮-β-萘酚为1个MAO单位。【参考范围】12～40U/ml(12×103～40×103U/L)。【临床意义】：肝硬化时，肝纤维化现象十分活跃，MAO活性明显升高。

血清胆红素测定重氮盐法胆红素氧化酶(bilirubin

oxidase,BOD)法高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)、导数分光光度法直接分光光度计法测定方法1．重氮盐改良J-G(JendrassikandGrof

method,J-G)法(1)原理:血清中结合胆红素与重氮盐反应生成偶氮胆红素；同样条件下，游离胆红素需要在加速剂作用下，使游离胆红素分子内的次级键断裂，极性上升并与重氮试剂反应。反应完成后加入终止试剂，继而加入碱性酒石酸钾钠使紫色偶氮试剂转变为蓝色，波长600nm下比色分析，求出血样中总胆红素的含量。(2)方法评价：推荐的常规方法，其方法的线性范围较宽，在342µmol/L(200mg/L)浓度下有较好的准确性和精确性，高浓度时准确性和精确性降低。因此，建议浓度过高时减少血样用量测定。【临床意义】【参考范围】

黄疸的鉴别诊断总胆红素:5.1～19.0μmol/L(0.3～1.1mg/dL)直接胆红素:1.71～6.8μmol/L(0.1～0.4mg/dL)2．胆红素BOD测定法(1)原理:BOD在不同pH条件下催化不同组份的胆红素氧化生成胆绿素，胆绿素与氧进行非酶促反应转变为淡紫色化合物，胆红素的最大吸收峰在450nm

附近。随着胆红素被氧化,450nm下降，下降程度与胆红素浓度成正比。；在pH8.0条件下,未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，用于测定总胆红素,在pH=4.5的酸性条件下，BOD仅能催化结合胆红素和大部分δ胆红素，而游离胆红素不被氧化，测定其含量代表结合胆红素。(2)方法评价：BOD法测定总胆红素的准确性、精密度比改良J-G法好【参考范围】血清总胆红素：10.26±4.10µmol/L血清结合胆红素：2.57±2.56µmol/L胆红素µmol/L=胆红素mg/LX17.1【临床意义】见重氮比色法四、血清胆汁酸测定高效液相色谱法放射免疫分析法酶免疫分析法比色分析测定法测定方法(1)酶比色法测定原理3α-HSD胆汁酸+NAD+3-氧-5β类固醇+NADH（1）

NADH+NBT甲jie（蓝色化合物λ=540nm）（2）

3-氧-5β类固醇+NAD+3-氧-5β类固醇+NADH（3）黄递酶△4-DH酶比色法由于胆汁酸在血中含量低，方法检测的灵敏度达不到要求，通过增加3-氧-5β-类固醇脱氢酶(△4-DH)，胆汁酸经3α-HSD催化的产物3-氧代胆酸在△4-DH作用下再次脱氢，加大了NADH的生成量，提高了反应的检测能力（见反应式1、2、3）。但以上两种方法都存在一个缺点：生成的蓝色产物是一种染料，易于附着管壁，难于清洗或堵塞管道。酶循环法测定原理为：NAD+

Thio-NADThio-NADH胆汁酸3-氧代胆汁酸NADH3α-HSD(2)酶比色测定法评价：快速、简便、准确、可靠和适用的优点。它即可以手工操作、也可以在自动化仪器上进行。但试剂价贵、不易保持。对酶量的要求严格，以保证酶