广西地方标准牛支原体的检测多重聚合酶链反应法（征求）

ICSFORMTEXT11.220FORMTEXTB41FORMTEXTDBFORMTEXT45DBFORMTEXT45/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2021FORMTEXTFORMTEXT牛支原体的检测多重聚合酶链反响法FORMTEXTDetectionofMycoplasmabovisbyMuti-polymerasechainreactionFORMTEXT点击此处添加与国际标准一致性程度的标识FORMDROPDOWNFORMTEXT〔本稿完成日期：2021年12月10日〕FORMTEXT2021-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXT2021-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT广西壮族自治区质量技术监督局发布目次TOC\h\z\t"前言、引言标题,1,参考文献、索引标题,1,章标题,1,参考文献,1,附录标识,1,一级条标题,3,二级条标题,4,附录章标题,3"前言 III1范围 12标准性引用文件 13术语和定义 13.1牛支原体 13.2无乳支原体 13.3聚合酶链式反响 13.4多重聚合酶链反响 13.5引物 13.6特异性引物 24生物平安措施 25防污染措施 26试验材料 26.1特异性引物 26.2试剂 26.3仪器设备及耗材 37操作程序 37.1待检样品处理 37.2待检样品DNA提取 37.3多重PCR检测 37.4阳性及阴性对照 47.5电泳 48结果判定 4附录A〔标准性附录〕特异性引物序列及检测结果凝胶电泳图示 5附录B〔标准性附录〕试剂的配制 7附录C〔标准性附录〕溴化乙锭溶液及废弃溴化乙锭接触物的净化处理 9前言本标准按照GB/T1.1—2021给出的规那么起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承当识别这些专利的责任。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本标准主要起草人：李军、彭昊、杨威、潘艳、陈泽祥、陶立、冯世文、韦志锋、许力干、马春霞、兰美益、秦假设甫、谢永平牛支原体的检测多重聚合酶链反响法范围本标准规定了多重聚合酶链反响法〔Multi-PCR〕检测牛支原体和无乳支原体的术语和定义、生物平安措施、防污染措施、试剂与器材、操作程序、结果判定等。本标准适用于牛支原体和无乳支原体的检测。标准性引用文件以下文件对于本文件的应用是必不可少的。但凡注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。但凡不注日期的引用文件，其最新版本〔包括所有的修改单〕适用于本文件。GB19489实验室生物平安通用要求NY/T541动物疫病实验室检验采样方法术语和定义以下术语和定义适用于本文件。牛支原体mycoplasmabovis,(M.bovis)是感染并引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎、流产与不孕等多种疾病的致病性病原体。无乳支原体mycoplasmaagalactiae,(M.agalactiae)是引起牛支原体性乳腺炎的病原体，可导致牛群的急性地方性乳腺炎，并随后演化为慢性乳腺炎。急性发作后可出现慢性乳腺炎或间断性急性爆发，呈亚临床感染。聚合酶链式反响polymerasechainreaction,PCR又称特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，简称PCR技术，是模板DNA在引物和4种脱氧核糖核苷酸及Mg2+存在的条件下，依赖于TaqDNA聚合酶的酶促反响。多重聚合酶链反响multiplexpolymerasechainreaction,Multi-PCR简称Multi-PCR，是PCR技术的一种特殊形式。Multi-PCR技术是在同一PCR反响体系里参加两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反响，可用于多种病原体的快速鉴定。引物primer与待扩增DNA片段两端互补的一段寡核苷酸。特异性引物specificprimer针对特定模板DNA片段设计的一段互补寡核苷酸，在PCR反响中与模板DNA特异性结合。生物平安措施实验室人员的平安，应在具备生物平安操作条件的实验室〔兽医生物平安二级以上实验室〕以及具备相应为了保护实验室人员的平安，应由具备相应资质的工作人员检测牛支原体，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。防污染措施应符合NY/T541的规定。试剂与器材特异性引物牛支原体、无乳支原体扩增目的片段大小分别为448bp、375bp，引物使用浓度为25mmol/L。引物序列见附录A.1。使用前用灭菌双蒸水稀释，然后分装成小剂量置于-20℃保存备用。试剂基因组提取试剂盒细菌基因组提取试剂盒。PCR试剂PCR试剂如下：2×TaqPCRMasterMix［0.1ＵTaqPolymerase／μL、500μmol／LdNTPs、20mmol／LTris-HCl〔pH8.3〕、100mmol／LKCl、3mmol／LMgCl2、其他稳定剂和增强剂］。电泳试剂电泳试剂如下：10mg/mL溴化乙锭；1×Tris-硼酸电泳缓冲液。其它试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。其它试剂如下：灭菌双蒸水：纯度至少为分析纯以上；双抗。试剂配制方法试剂配制方法见附录B。仪器设备及耗材仪器设备本方法使用以下仪器设备：PCR仪；电泳仪:输出直流电压0V～600V；电泳槽；紫外光透射仪或凝胶成像系统；小型高速离心机：转速12000r/min以上；；-20℃旋涡振荡器；烧杯；微量加样器：100µL～1000µL、20µL～200µL、10µL～100µL、0.5µL～10µL等多种规格。一次性耗材本方法使用以下一次性耗材：一次性手套；离心管：1.5mL；PCR反响管：0.2mL；吸头：1000µL、200µL、10µL等多种规格。操作程序待检样品处理取适量待检病料样品〔肺脏、关节液和鼻拭子〕用含双抗的双蒸水浸泡后研磨，置灭菌烧杯充分搅匀，然后取适量至1.5mL离心管中供DNA提取或置-20℃保存备用。待检样品DNA提取将7.1处理过的病料样品反复冻融处理三次后，按基因组DNA提取说明书提取模板DNA，获得50µLDNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中进行后续反响或置-20℃保存备用。多重PCR检测在冰浴条件下，在PCR反响管中按总体积为25µL，分别参加2×TaqPCRMasterMix12.5µL；灭菌双蒸水7.5µL；牛支原体上、下游引物〔M.bovieP1和M.bovieP2〕各1µL；无乳支原体上、下游引物〔M.agalactiaeP1和M.agalactiaeP2〕各1µL；待检样品DNA：3µL。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反响管置于PCR仪内，按如下程序进行PCR反响：95℃4min；然后进入95℃30s，55℃40s,72℃40s的连续30次循环；72℃5min；4℃结束扩增。PCR产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置-20阳性及阴性对照阳性对照用牛支原体和无乳支原体作为阳性对照，DNA提取程序按照7.2，多重PCR检测程序按照7.3。阴性对照用灭菌双蒸水作为阴性对照，多重PCR检测程序按照7.3。电泳制胶制备1.5%琼脂糖凝胶板，见附录B.1。加样将10µLPCR产物，加至琼脂糖凝胶样品孔中。同时设置标准DNA分子量对照。电泳条件以5V/cm凝胶长稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2cm～3cm时停止。废弃物处理废弃的溴化乙锭或含溴化乙锭的电泳液、凝胶等要集中回收处理，处理方法按照附录C。结果判定每次检测必须设置阳性与阴性对照。结果判定时，必须在阳性与阴性对照结果均正确时才能进行受检样本的结果判断。如果样品按照牛支原体双重PCR体系扩增后的产物在448bp、375bp位置出现特异性条带，判定为牛支原体阳性、无乳支原体阳性；在448bp、375bp位置均未出现特异性条带，判定为牛支原体阴性、无乳支原体阴性。如果样品在448bp位置出现特异性条带，而在375bp位置未出现特异性条带，判定为牛支原体阳性、无乳支原体阴性。如果样品在375bp位置出现特异性条带，而在448bp位置未出现特异性条带，判定为牛支原体阴性、无乳支原体阳性。检测结果凝胶电泳图见附录A.2。

〔标准性附录〕

特异性引物序列及检测结果凝胶电泳图示特异性引物序列牛支原体特异性引物M.bovie引物核苷酸序列M.bovieP1:5'-CGTTATGCAAGATTAAATACTTACGAC-3'M.bovieP2:5'-TGAAAACTTTCTCAGCATTAGCC-3'引物扩增的目的基因oppD/F基因。无乳支原体特异性引物M.agalactiae引物核苷酸序列M.agalactiaeP1:5'-AAAGGTGCTTGAGAAATGGC-3'M.agalactiaeP2:5'-GTTGCAGAAGAAAGTCCAATCA-3'引物扩增的目的基因P80/F基因。多重PCR检测结果凝胶电泳图示多重PCR检测结果凝胶电泳图如图A.1所示。1、标准DNA分子量〔DNAmarkerΙ〕；2.牛支原体〔＋〕，无乳支原体〔＋〕；3.牛支原体〔＋〕，无乳支原体〔-〕；4.牛支原体〔-〕，无乳支原体〔＋〕；5.牛支原体〔-〕，无乳支原体〔-〕“＋〞表示检测结果为阳性；“—〞表示检测结果为阴性。多重PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图

〔标准性附录〕

试剂的配制1.5%琼脂糖的制备琼脂糖：1.5g；1×Tris-硼酸电泳缓冲液：加至100mL。0.5mol/LEDTA〔pH8.0〕的配制0.5mol/LEDTA〔pH8.0〕按以下方法进行配制：二水乙二胺四乙酸二钠〔EDTA-Na2·2H2O〕：186.1g；氢氧化钠：20.0g；双蒸水：定容至1000mL。在800mL双蒸水中参加186.1gEDTA-Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0〔约需20.0g氢氧化钠颗粒〕，然后定容至1000mL，分装后1.034×105Pa高压灭菌3010mg/mL溴化乙锭的配制10mg/mL溴化乙锭按以下方法进行配制：溴化乙锭〔EB〕：1.0g；双蒸水