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复习三蛋白质一、概述二、结构三、结构与功能的关系四、蛋白质的重要性质五、蛋白质含量测定六、蛋白质的分离提纯一、概述（一）蛋白质的重要作用；（二）蛋白质的分类；（三）蛋白质的元素组成（一）蛋白质的功能1.催化功能-酶2.调控功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜蛋白、血红蛋白4.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白5.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架6.防御功能-免疫球蛋白（抗体、补体）7.信号传递-受体8.营养贮存-卵清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、酪蛋白9.异常作用-毒素1、依据外形分类球状蛋白质：globularprotein

外形接近球形或椭圆形，溶解性较好纤维状蛋白质：fibrousprotein

形似纤维或细棒，分可溶性/不溶性两种膜蛋白质：membraneprotein

亲水性残基少于胞质蛋白（二）蛋白质的分类2、依据蛋白质的组成分类简单蛋白

simpleprotein

单纯蛋白，仅由氨基酸组成结合蛋白

conjugatedprotein由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成简

单

蛋

白清蛋白和球蛋白

albuminandglobulin

广泛存在于动物组织谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱精蛋白和组蛋白碱性蛋白存在于细胞核硬蛋白存在于软骨、腱、毛发、丝等组织中，分为角/胶原/弹性/和丝蛋白等结

合

蛋

白色蛋白简单蛋白+色素物质如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素糖蛋白：简单蛋白+糖类物质脂蛋白：简单蛋白+脂类结合核蛋白：简单蛋白+核酸（三）元素组成蛋白质是一类含氮有机化合物碳50％氢7％氧23％氮16%

硫0—3％其他微量蛋白质的含氮量蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数

6.25凯氏定氮法二、结构（一）肽及肽平面（二）蛋白质一级结构的概念和测定方法（三）蛋白质空间结构（四）蛋白质分子中的共价键与次级键

（五）蛋白质二、三、四级结构的概念；类型、稳定因素（一）肽和肽平面由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基（酰）。1、肽：AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为Ser-Val-Tyr-Asp-Gln重要的肽：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

Glu------Cys------GlySH还原型谷胱甘肽

Glu------Cys------GlyS

SGlu------Cys------Gly

氧化型谷胱甘肽2、肽平面肽单位平面结构的特征

单键可自由旋转，双键不能自由旋转

肽键中C-N键具有部分双键性质，因此组成酰平面的原子处于同一平面原因：

C、O、N三个原子的电子共振

共振形式

酰胺平面与α－碳原子的二面角肽平面键长和键角一定肽键的原子排列呈反式构型相邻的肽平面构成两面角多肽链＝通过可旋转的α-碳原子连接的酰胺平面链但这种旋转是受到限制的共价主链

共价主链：由羧基C、氨基N及-Cα形成的链（二）蛋白质的一级结构的概念(Primarystructure)（1）组成蛋白质的多肽链数目.（2）多肽链的氨基酸顺序，（3）多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。胰岛素：A链：21个AAB链：30个AA

两个链间二硫键一个链内二硫键

（三）蛋白质的空间结构构型：原子的连接方式构象：原子的空间排布蛋白质的三维结构二级结构三级结构四级结构（超二级结构和结构域）蛋白质结构的层次（四）蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子内部的作用力肽键、二硫键、酯键、配位键氢键、疏水作用、范德华力、离子键（1）肽键：（2）二硫键(DisulfideBond)：由含硫氨基酸形成。在蛋白质分子中，起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键被破坏，蛋白质的生物活性丧失。（3）配位键(Metal-ionCoordination)：两个原子之间形成的共价键，共用电子对由其中的一个原子提供。金属离子与蛋白质的结合往往是配位键，例如：铁氧还蛋白、羧肽酶等。（4）酯键(EsterBond)：磷酸与含羟基氨基酸缩合形成磷酸酯键。（5）离子键

(Electrastaticattraction)又称盐键，一种具有相反电荷的两个基团之间的库仑作用。这种键可以解离。（6)氢键(Hydrogenbond)氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成。X—H…Y它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。（7)范德华力

(vanderWaalsforce)

这是一种普遍存在的作用力，是原子、基团或分子之间比较弱的、非特异性的作用力。（8）疏水作用

(HydrophobicInteractions)

非极性侧链在极性溶剂水中为了避开水相而彼此靠近所产生的一种作用力。主要存在蛋白质的内部结构。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。

键能肽键

二硫键离子键

氢键疏水键

范德华力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称次级键次级键微弱但却是维持蛋白质三维结构中主要的作用力,原因何在?数量巨大（五）蛋白质二、三、四级结构的概念、类型、稳定因素1、蛋白质的二级结构(SecondaryStructure)是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及共价主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。

螺距为0.54nm含3.6个氨基酸残基13个原子3.613每个AA残基占0.15nm转1000肽链内形成氢键通常，蛋白质分子为右手-螺旋（1）-螺旋结构

影响α螺旋形成的因素：

①R基的大小：较大的难形成，如多聚Ile②R基的电荷性质：不带电荷易形成③Pro：（1）-NH参与环的形成，C

-N不能旋转（2）无法提供质子，不能形成链内氢键2008考题

由360个氨基酸残基形成的典型

-螺旋，其螺旋长度是

A54nmB36nmC34nmD15nm（2）-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象；

-pleatedsheet在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直；-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。（3）β转角

肽链主链骨架180°的回折结构特点：由4个连续的AA残基组成第一个残基C=O第四个残基NH形成氢键作用力是氢键只形成

O……（氢键）………H

—C—（NH—CH—CO）2—N—R这类结构主要存在于球状蛋白分子中。多数处在蛋白质分子的表面。（4）无规卷曲

泛指不能归入明确的二级结构如折叠片和螺旋的多肽片断2、超二级结构：若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起，相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位。

、

3、结构域：二级或超二级结构基础上形成的特定区域。结构域存在的原因：1、局域分别折叠比整条肽链折叠在动力学上更为合理2、结构域与结构域之间由肽链连接，有利于结构的调整4、蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。单链蛋白的最高级结构是三级结构球状蛋白质三维结构的特征（1）含多种二级结构元件（2）三维结构具有明显的折叠层次（3）分子是“紧密”的球状/椭球状实体——活性部位密度较低，有空间可塑性（4）疏水核和亲水膜（5）表面空穴——营造疏水环境、活性功能部位

维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。

肌红蛋白

153AA5、蛋白质的四级结构(QuaternaryStructure）指由多条各自具有一、二、三级结构的亚基通过非共价键连接起来的结构形式亚基：最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，它一般由一条肽链构成，或是由二硫键连到一起的肽链构成，单独无生理活性。四级结构就是各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。四级结构中无二硫键由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。

亚基血红蛋白血红蛋白四亚基两两相同，分别称为α1、α2、β1、β2；亚基：具有独立三级结构的肽链单独亚基无生物功能血红蛋白研究对象：几个亚基，相同否？怎样连接

作用力：

稳定四级结构的作用力：结构互补（极性）和非共价键

主要是疏水作用判断题：※球状蛋白分子含有极性基因的氨基酸残基在其内部，所以能溶于水。※蛋白质的亚基和肽链是同义的※疏水作用是使蛋白质立体结构稳定的一种非常重要的次要键

※蛋白质四级结构是第四度空间的蛋白质结构，即蛋白质结构因时间而变化的关系※蛋白质分子中个别氨基酸的取代未必会引起蛋白质活性的改变※二硫键和蛋白质的三级结构密切相关，因此没有二硫键的蛋白质就没有三级结构三、结构与功能的关系（一）多肽结构与功能的关系（二）蛋白质一级结构与功能的关系

（三）空间结构与功能的关系

（一）多肽结构与功能的关系（二）蛋白质一级结构与功能的关系

1、具相同序列的蛋白质具相同的功能

名词解释：

来自不同生物体执行但同一或相似功能的蛋白质称同源蛋白质；

同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，称为序列同源性。

保守的氨基酸残基为不变残基

发生变化的氨基酸残基为可变残基

胰岛素

51个残基，24个不变残基

尤其是6个Cys，以及由它们维持的3对二硫键

细胞色素C与系统树

104个残基，28个不变残基

来自任两个物种的细胞色素C的序列间的氨基酸差异数目与这些物种间的系统发生差异是成比例的，也即在进化位置上相差愈远，其氨基酸序列之间的差别愈大。

细胞色素C的氨基酸序列差异可用于核对各个物种之间的分类学关系以及绘制系统树或称进化树。

狗人猴

马骡

鲸兔猪袋鼠企鹅鸡鸭响尾蛇龟苍蝇蛾脉孢菌属念珠菌属面包酵母菌小麦牛蛙金枪鱼动物爬行动物两栖动物鱼哺乳动物鸟昆虫植物脊椎动物从细胞色素C的一级结构看生物进化2008年考题简述蛋白质的一级结构与生物进化的关系(8分）

2、一级结构变化导致功能变化

———酶原激活胰岛素前体胰岛素原胰岛素信号肽血液凝固与

氨基酸序列的局部断裂

凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网可溶性的血纤蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纤蛋白网3、一级结构变异与分子病

分子病：由于基因突变，导致蛋白质中的氨基酸种类发生变化，并引起功能降低或丧失。

镰刀型贫血症：血红蛋白聚集为纤维状镰刀状贫血病—血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息正常细胞镰刀形细胞正常型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys---β链

谷氨酸镰刀型

---Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys---β链

缬氨酸谷A（极性）缬A（非极性）纤维状沉淀结论：功能由关键部位的氨基酸决定

（三）空间结构与功能的关系

1、血红蛋白与肌红蛋白血红蛋白4个亚基肌红蛋白1条肽链

亚基血红蛋白四亚基两两相同，分别称为α1、α2、β1、β2；肌红蛋白

血红蛋白α

血红蛋白β氨基酸序列大不相同，功能相似（载氧）说明：

空间结构相似结构决定功能2、肌红蛋白对氧的结合很快达到饱和血红蛋白对氧的结合能力与氧分压有关

因为血红蛋白具有4个亚基，有变构现象，有紧张态和松弛态

氧结合引起的Hb的构象变化变构脱氧血红蛋白氧合血红蛋白对氧的亲和力低对氧的亲和力高氧合作用改变Hb四级结构动脉血中：氧分压高，Hb为松弛态，有利于和氧结合组织深处：氧分压低，Hb为紧张态，不利于和氧结合，有利于氧的释放3、蛋白质的变性和复性

变性定义：蛋白质的次级键破坏,天然结构解体,引起生物活性丧失,溶解度降低以及其它理化常数改变，但一级结构没有变化

变性因素：物理因素如热、紫外线照射、高压和表面张力；化学因素如有机溶剂、脲、胍、酸、碱、重金属阳离子、生物碱试剂等变性表现：A.生物活性丧失B.一些侧链基团的暴露:更易与化学试剂反应、C.一些物理化学性质的改变:疏水基外露,溶解度降低,一般在等电点区域不溶解,分子相互凝集,形成沉淀。如有变性剂则仍保持溶解状态D.生物化学性质的改变，分子结构伸展，易被酶解

尿素/盐酸胍竞争主链氢键破坏二级结构有机溶剂SDS破坏分子内疏水作用非极性基团暴露强酸/碱破坏氢键、离子键重金属阳离子与带负电荷基团结合不溶性金属蛋白盐生物碱试剂与带正电荷基团结合不溶性蛋白盐

复性：当变性因素除去后，变性蛋白质重新回复到天然结构的现象。复性后的蛋白质亦回复其生物活性，如核糖核酸酶吴宪

1.蛋白质的功能是由空间构象决定的2.蛋白质的空间构象是由关键部位的氨基酸顺序决定的3.关键部位氨基酸的变化会引起功能发生变化四、蛋白质的重要性质（一）蛋白质的两性电离及等电点（二）蛋白质的电泳（三）蛋白质分子的大小及测定（四）蛋白质的胶体性质（五）蛋白质的沉淀（六）蛋白质的呈色反应（一）

蛋白质的两性电离及等电点为什么蛋白质具有两性（酸、碱性）？含有酸碱氨基酸残基碱/酸越大pI

？

越小pI通常在6.0左右

（二）蛋白质的电泳蛋白质颗粒电泳时，迁移率由以下因素决定：所带电荷分子量分子形状（三）蛋白质分子的大小及测定

蛋白质的分子量一般在一万至一百万道尔顿1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）变性后的肽链带相同的电荷，均为线形分子，迁移率只和分子量有关凝胶法只适于球状蛋白分子测量蛋白质混合样2、凝胶过滤法60000~80000转/分重力60万～80万倍(3)沉降速度法（四）蛋白质的胶体性质胶体溶液的特点是什么？分子直径在1-100nm内，溶于水，且不易聚集沉淀（稳定）。大多数球状蛋白，分子直径在胶体溶液范围。溶于水，能形成稳定的胶体溶液。蛋白质胶体溶液的稳定的原因是什么？1.同种蛋白质带有同种电荷，相互排斥，与反离子构成双电子层；2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质（五）蛋白质的沉淀

Pr从胶体溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解

——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等

不可逆沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱试剂沉淀等Ⅱ1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。分段盐析法盐析（（NH4）2SO4）

硫酸铵的优点：

1、溶解度高，不受温度影响

2、中性，不会引起pH发生变化

3、价廉2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态（六）蛋白质的呈色反应1、双缩脲2、黄蛋白反应3、茚三酮反应尿素

双缩脲

紫红色络合物双缩脲反应

双缩脲反应是含有跟双缩脲一样或近似结构的化合物，如Pr(肽)，所特有的；此外含有一个肽键和一个结构类似于肽键的化学键的化合物，也产生此反应；NH3

也能跟Cu2+

产生暗蓝色的络合物：(暗蓝色)

黄色反应

含有苯环结构的氨基酸(Phe、Trp、Tyr)遇硝酸后可被消化成黄色物质，此物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠（Phe不易消化，要见黄色反应，需加少许浓硫酸）。

硝基酚(黄色)邻硝醌酸钠(橙黄色)五、蛋白质含量测定（一）凯氏定氮法（二）紫外分光光度法（三）Lowry（福林-酚）法（四）考马斯亮蓝法（五）双缩脲法Lowry（福林-酚）法

Tyr+福林酚试剂蓝色深浅与含量存在线性关系。蓝色化合物碱性条件（钼蓝和钨蓝的混合物）考马斯亮蓝显色法原理考马斯亮蓝G－250与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm；蛋白质－染料复合物有较高的消光系数，蛋白最低检出量为1微克，灵敏度高；反应迅速，2min，且结合物在1h内稳定；干扰物质少。六、蛋白质的分离提纯（一）概述（二）根据分子大小不同的纯化方法（三）利用溶解度差别的纯化方法（一）

概述总目标：增加制品纯度或比活1、前处理因动/植物/细菌而异

把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢失生物活性。常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体,

即形成很多小气泡。由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。2、

粗分级

分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大.3、细分级

样品的进一步纯化。样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。(二)根据分子大小不同的纯化方法1.

透析

利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。2.

密度梯度离心

蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。3.

凝胶过滤

利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。大分子先被洗脱下来。小分子后被洗脱(三)利用溶解度差别的纯化方法1．等电点沉淀和pH的控制

蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最底点，利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。2.蛋白质的盐溶和盐析

中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水相互作用加强了，因而溶解度增加

当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。

盐析作用的主要原因是大量中性盐的加入使水的活性降低，原来溶液的大部分甚至全部的自由基水转变成盐离子的水化水，使蛋白质表面疏水侧链暴露例：用硫酸铵分离血清白蛋白和球蛋白一、目的要求

了解盐析法分离蛋白质的原理及操作方法

二、实验原理

在一定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗粒失去电荷和水膜，则沉淀析出。这时所获得的蛋白质沉淀，能保留蛋白质原来的性质。蛋白质在不同浓度的盐溶液中，其溶解度不同，例如球蛋白不溶于半饱和的硫酸铵溶液，在半饱和硫酸铵溶液中沉淀析出；而白蛋白则溶于半饱和的硫酸铵溶液，但不溶于饱和硫酸铵，在饱和的硫酸铵溶液中才沉淀析出，因此可以利用不同浓度的硫酸铵将血清或其他混合蛋白液中的白蛋白与球蛋白分离。三、仪器和试剂

1、仪器：试管和试管架、漏斗、定量滤纸。

2、试剂：血清、饱和硫酸铵溶液

四、实验步骤

取1：2稀释血清2ml，加饱和硫酸铵溶液2ml，混匀，静置10分钟后过滤。取沉淀备用。

例：葡聚糖G25凝胶过滤去盐一、目的要求

了解用葡聚糖G25凝胶过滤去盐的基本原理和操作方法

二、实验原理

葡聚糖G25凝胶是一种“分子筛”的分离法，当欲分离的物质通过葡聚糖G25凝胶时，分子量大的物质（如蛋白质）沿凝胶颗粒间隙随溶剂流动，流程短，移动速度快先流