GBS核酸检测课件

GBS核酸检测1aGBS概述2aGBS概述

B族链球菌(GroupBStreptococcus,GBS)学名无乳链球菌，革兰氏阳性链球菌，正常寄居于阴道和直肠，属于条件致病菌。在20世纪70年代，GBS已被证实为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。3a什么是围产期……国外研究表明，不同地区、不同种族的妊娠晚期妇女GBS带菌率约为6.5％～36.0％，国内报道的妊娠妇女GBS带菌率为3.5%～32.4％，新生儿体表带菌率与母体带菌率相似。在一些特殊人群，如肥胖、糖耐量异常、多次妊娠以及性生活活跃的妇女中带菌率较高。人群GBS带菌率是指怀孕28周到产后一周这一分娩前后的重要时期围产期保健是指产前、产时和产后的一段时间内，对母亲、胎儿和新生儿进行一系列的保健工作，使母亲健康和胎儿、新生儿的成长发育得到很好的保护。4aGBS对孕妇的影响GBS感染是胎膜早破的重要发病因素GBS对绒毛膜有较强吸附能力和穿透能力，接种2小时内即可吸附于母体组织，继而侵入绒毛膜，通过炎症细胞的吞噬作用及细菌产生的蛋白水解酶的直接侵袭，使胎膜局部张力减低，从而导致胎膜早破。GBS生殖道感染是导致早产的重要因素

GBS引起泌尿生殖道感染时，会引起磷脂酶A2和前列腺素及细胞因子的释放，刺激子宫收缩导致早产。GBS是造成产褥感染的主要致病菌之一产褥感染是指分娩时及产褥期生殖道受病原体感染，引起局部和全身的炎性应化。产褥感染发病率为1%～7.2%，是产妇死亡的原因之一。5aGBS对新生儿的影响GBS感染是新生儿感染的主要原因早发型感染多见于出生后1周内。母婴垂直传播是其主要传播途径。主要临床表现为败血症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。晚发型感染多发生于出生1周后。主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更易发生神经系统后遗症。6aGBS的传播与感染感染GBS产妇

未传染给新生儿30~60%传染给新生儿40%~70%无症状97%早发性疾病：败血症，肺炎或脑膜炎1%~3%5%会导致死亡7a国内外GBS筛查现状美国疾病控制中心(CDC)制定了《围产期GBS预防指南》该指南已经获得以下认可：美国妇产科学院美国儿科学会美国护士助产士协会美国家庭医生协会美国微生物学会美国流行病学会美国药理学会在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南(第1版)》中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。8a《围产期GBS预防指南》指出对所有孕妇于妊娠35～37周进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗以下情况应进行预防性治疗：本次妊娠有GBS菌尿上次新生儿GBS感染史在妊娠37周之前分娩

破膜时间超过18小时

分娩体温超过38.0度9aGBS的筛查与预防阳性(+)或产时高危因素：早产，产时发热≥38℃，胎膜早破≥18小时不需要抗生素预防孕35-37周取阴道和直肠拭子作GBS检测阳性(+)抗生素预防未检测阴性(－)临产后GBS检测阴性(－)且无产时高危因素抗生素预防10a预防GBS疾病的抗生素使用方案举例:《围产期GBS预防指南》指出：

GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗Boyer在1989年研究中指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不足2小时的有效率为71%。挑战：我妈妈会进行IAP治疗吗？11a有无青霉素过敏否是青霉素G，首次剂量500万单位（静脉注射）然后每4小时250〜300万单位，直至分娩或者氨苄青霉素，首次剂量2g（静脉注射），然后每4个小时1g，直到分娩病人在接受青霉素或头孢菌素时有无出现下列任一症状？过敏症、血管性水肿、呼吸窘迫、荨麻疹否是头孢唑啉，首次剂量2G，然后每8个小时1g，直到分娩红霉素和克林霉素治疗是否有效否是万古霉素每12小时1g（静脉注射）直至分娩克林霉素每8小时900mg（静脉注射）直至分娩《围产期GBS预防指南》12aGBS检测方法比较13aPCR介绍14a聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作生物体外的特殊DNA复制。

什么是PCR……

PCR原理PCR一般由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。②退火：（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

15aPCR原理变性，退火，延伸一次循环二次循环三次循环16aPCR反应体系PCR反应体系中的主要试剂有：

17aPCR扩增仪PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。国外厂家：Bio-Rad，ABI,Roche……

国内厂家：杭州朗基，杭州博日……18aPCR反应特点特异性强：引物与模板DNA特异正确结合，碱基配对原则，TaqDNA聚合酶忠实性扩增灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平简便快速：一般在1～4小时完成扩增反应模板纯度要求低：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板

19a1.每扩增一条DNA链，就切断一个探针2.每切断一个探针，就产生一个单位荧光信号3.荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对模板进行分析的方法。

20aGBS核酸检测产品21a荧光PCR检测B族链球菌（GBS）

22aB族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)23aTaqman探针实时PCR技术选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计特异性引物和探针内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性适用仪器：RocheLightCycler480，ABI7500，BioerLine-GeneK等多色荧光PCR仪产品特点24a规格：20人份/盒有效期：－18℃以下避光保存6个月试剂：DNA提取液、GBSPCR反应液、GBS阳性对照品，空白对照品标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本试剂盒介绍25a

溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免这些样本的检测。

其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-18℃以下保存不超过4天。标本要求标本保存26a检测流程（＜2h）35min5min1h10minPCR扩增结果分析分装GBSPCR反应液加DNA模板PCR反应体系配制PCR扩增及结果分析DNA提取

标本GBS阳性对照品空白对照品27aDNA提取1mL标本沉淀+1mL生理盐水沉淀+50μLDNA提取液99-100℃加热10min取上清至1.5mL离心管中保存13,000rpm10min13,000rpm5min13,000rpm10min标本，GBS阳性对照品，空白对照品均需要提取DNA。28aPCR体系配制

40μL体系：35μLPCR反应液+5μLDNA模板PCR扩增程序：50℃2min95℃5min（95℃15s60℃35s）45cycles实时监测PCR扩增过程FAM通道HEX通道29aFAM通道检测结果：分析样本，空白对照品：Ct值不显示；阳性对照品：Ct<30.00；HEX通道检测结果：

分析内参照基因，Ct≤35.00

阴性：样品的FAM通道无Ct值显示,HEX通道Ct≤35.00

阳性：

样品的FAM通道Ct≤38.00，HEX通道Ct≤35.00备注：若样品的FAM通道38.00<Ct≤45.00，建议重新检测该样本，

若重检结果仍为38.00<Ct≤45.00或Ct≤38.00，判定为阳性；

若Ct不显示且HEX通道Ct≤35.00，判定为阴性。结果有效性判定结果分析以上要求需在同一次实验中同时满足30a产品优势一灵敏度高：采用PCR方法检测DNA，试剂与国际领先试剂性能相同特异性强：不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应稳定性好：样本DNA提取质量高，阳性对照品、空白对照品内参基因扩增曲线高度吻合，试剂稳定无污染：全封闭PCR体系，避免实验室其它PCR产物污染

易操作：操作简便，采用预制PCR反应液，无需额外加入内参照基因、酶等

速度