(第二章)药物分析-光谱分析法的应用课件

*光谱分析法：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱系的特征来确定物质性质、结构或含量的方法。第二章光谱分析法的应用吸收光谱分析发射光谱分析散射光谱分析光谱分析可见分光光度法紫外分光光度法红外分光光度法原子吸收光谱法荧光分析法火焰光度法比浊法√√√√光是电磁波，其能量（辐射能）可以用波长来表示第二章光谱分析法的应用物质吸收可见光和紫外光则引起价电子跃迁物质吸收红外光则引起分子振动紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱*分子吸收光谱：当光通过固体、液体或气体的透明层时，分子可以选择性地吸收一定波长的光，透过的光谱中就不出现这些波长的光，这种光谱称为吸收光谱。紫外-可见分光光度法第一节可见—紫外分光光度法的应用吸收光谱的吸收强度在实验上可用朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律来描述。这条定律是吸收光的基本定律，也是吸收光谱测量的理论基础。当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要降低，溶液的浓度越大，液层的厚度越大，吸收的光能越多，光强度减弱也越显著，可用下式来表示：第二章光谱分析法的应用紫外-可见分光光度法吸收度与溶液的浓度及液层的厚度成正比；*吸收系数（Absorptivity）：单位浓度、单位液层厚度的吸收度。紫外-可见分光光度法摩尔吸收系数：指1升溶液中含有1摩尔溶质，液层厚度为lcm时，在指定波长和一定条件（溶剂、pH、温度）下的吸收度，用ε表示，单位是克分子-1厘米-1。百分吸收系数：指100m1溶液中含有1g溶质，液层厚度1cm时，在指定波长和一定条件下所测得的吸收度，用或

表示，单位是克-1厘米-1。摩尔吸收系数与百分吸收系数的相互关系为：

M：吸光物质的分子量（摩尔质量）。紫外-可见分光光度法物质的吸收系数与溶剂的种类、溶液的pH、温度以及波长有关，测定时必需注意，表示吸收系数时这些条件应注明。测定吸收系数时，将仪器的波长调至最大吸收波长（λmax）处。紫外-可见分光光度法一、分析测定方法1．吸收系数法在无标准品的情况下，利用或

ε

进行定量。从有关手册或药典中查得化合物的吸收系数，然后采用与标准品相同的溶剂，配制样品溶液，在相同波长下测定A值，按下式计算百分含量：

在有标准品的情况下：紫外-可见分光光度法仪器型号和操作条件2.标准曲线法（常用）从待测物质的吸收光谱图上选定某一最大吸收波长，用一系列不同浓度的标准溶液在该波长处分别测定它们的吸收度。用吸收度对浓度作图，得标准曲线。在同样条件下测定样品溶液的吸收度，由标准曲线上可求出样品溶液的浓度。紫外-可见分光光度法3.直接比较法（单点校正）凡溶液中待测物质吸收符合吸收定律，则配制一种浓度的标准溶液，测其吸收度，再在同样条件下测样品溶液的吸收度，根据下列公式求出样品溶液的浓度。

A标为标准溶液吸收度C标为标准溶液浓度A样为样品溶液吸收度C样为样品溶液浓度紫外-可见分光光度法4．联立方程法若待测样品为两种以上不起化学反应的吸收物质，如其吸收光谱并不互相重叠，可按单位组分分析方法，分别在各组分的最大吸收波长处测定，如其吸收光谱互相重叠，根据吸收度的加和性原则，混合物的吸收度为各组分吸收度之和，可在各组分的最大吸收波长处，分别测混合物吸收度，通过解联立方程的方法求得结果，如下式：

1221紫外-可见分光光度法靛蓝和靛玉红的吸收光谱

靛蓝在608nm处、靛玉红在544nm处有最大吸收。根据Lambert-beer定律A=EC分别计算出4个比吸光系数。当波长为608nm时，E608靛蓝＝34.6，E608靛玉红＝6.9；当波长为544nm时，E544靛蓝＝19.6，E544靛玉红＝44.6。

当溶液为2种物质的混合溶液时：A608＝E608靛蓝×C靛蓝+E608靛玉红×C靛玉红A544＝E544靛蓝×C靛蓝+E544靛玉红×C靛玉红推导出：C靛蓝＝1.54×10-3×A608－1.87×10-4×A544C靛玉红＝3.65×10-3×A544－9.41×10-4×A6085．双波长分光光度法假设a为干扰组分，b为被测组分，虚线则代表吸光度上反映的值。又设在λ1和λ2处干扰组分的吸光度值相等，于是△A值反映在λ1和λ2处b组分的吸光度差异。

XYx1x2y1紫外-可见分光光度法a的曲线在波长λ1和λ2处吸收度相等，△Aa＝0；b物质的吸收曲线在Al和A2处A值相差很大，为△Ab;混合物在此二波长的△A即为b物质的△Ab（

）;b物质的含量则可用在λ1及λ2处测得的△Ab对浓度作图所得标准曲线上求出。

紫外-可见分光光度法测定步骤：（1）选择双波长。先用标准品测出两组分各自的吸收曲线，选干扰组分的吸收曲线上某对称两点（等吸收波长）的波长λ1和λ2，在此二波长处待测组分的吸收度应有明显差别。

（2）配制不同浓度的待测标准品，先在λ1处测出A1，再在λ2处测出A2，求出∆A。用各种浓度下的∆A对浓度C作图，绘出标准曲线。（3）混合物中待测组分的含量测定。在λ1和λ2处分别测得混合物的A1及A2，求出∆A，由标准曲线上查出浓度即为待测组分浓度。

紫外-可见分光光度法可见光区的波长范围为400~760nm，人的视觉可以察觉。

二、可见分光光度法分析若两种颜色的光按其适当的强度比例混合后可成为白色，则这两种光色被称为互补色，如绿与紫红、黄与蓝、橙与青蓝、红与青。有色溶液呈现的不同颜色，就是由于物质对光具有选择性吸收所造成的，例如高锰酸钾溶液由于吸收波长为500~560nm（绿色光）而显紫红色。

紫外-可见分光光度法可见分光光度法就是利用有色物质吸收光能的特性来测定物质含量的方法。药物内的各种有效成分或主成分，可用此方法进行分析的条件：1.成分本身有色；2.或与一定显色试剂作用后可形成有色物质；3.并且在一定浓度范围内，溶液的吸收度与浓度符合朗伯-比尔定律。

紫外-可见分光光度法1.黄酮类成分的测定

应用实例（1）标准曲线：精密称取120℃下干燥至恒重的无水芦丁10mg，用30%乙醇定容于100ml容量瓶中。分别取上述溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml容量瓶中，加入0.3ml5％亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml，放置6min，再加入1mol/l的氢氧化钠溶液4.0ml，30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，510nm处测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线方程为：Y=0.0018+1.0926XX：所测的吸光度Y：总黄酮的浓度R=0.9998紫外-可见分光光度法

应用实例（2）测定步骤：精密称取样品5g，提取，浓缩至近干，蒸馏水溶解后过滤。滤液用正丁醇萃取至无黄酮反应为止。减压回收正丁醇至近干，加30％乙醇溶解，过滤，移至50ml容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，稀释25倍。精密吸取3ml于10ml容量瓶中，按上述显色方法显色，用754紫外－可见分光光度计于510nm处测吸光度。（3）样品测定

应用实例2、环烯醚萜类（桃叶珊瑚苷）的测定（1）标准曲线：精密称取10mg标准品于容量瓶中配成1mg/ml母液，分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，加蒸馏水至1ml，依次加入1mlApstahl、1ml冰醋酸、2ml乙醇到5ml，80℃水浴中加热显色30min，中间摇动2~3次；取出流水冷却1min，然后在601nm处用754型紫外-可见分光光度计测溶液吸光度A；以浓度与相应的吸光度作标准曲线。标准曲线为：Y=0.11605A+0.00033R=0.9976紫外-可见分光光度法

应用实例（2）测定步骤：精密称取烘干样品5g，提取、浓缩、用蒸馏水定容于50ml容量瓶中，离心5min，取上清液1ml于25ml容量瓶中稀释后，取稀释液1ml，依次加入4ml乙醇、2ml对二甲氨基苯甲醛试剂（艾氏试剂）、2ml冰醋酸，用蒸馏水定容到10ml，充分摇匀；在80℃水浴中加热显色30min，中间摇动2～3次；取出试管，管内溶液根据浓度不同呈现不同深度的蓝色，流水冷却1min，然后在601nm处用分光光度计测溶液吸光度A；以标准曲线和校正方程计算样品中桃叶珊瑚苷含量。（3）样品测定

紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法1、显色化合物的吸收光谱桃叶珊瑚苷与Epstahl试剂在乙醇和醋酸溶液中形成的有色化合物的最大吸收波长为601nm，吸收曲线见图。桃叶珊瑚苷的分光光度法测定具体步骤桃叶珊瑚甙与Epstahl试剂形成的显色化合物在乙醇和醋酸中的吸收光谱紫外-可见分光光度法2、显色剂的用量桃叶珊瑚甙含量在2.0×10-2g/L以内时，加1mLEpstahl试剂可使1mL试液中的桃叶珊瑚苷完全形成稳定的有色化合物。显色剂较少时，吸光度偏低；较多时影响不大。紫外-可见分光光度法3、冰醋酸用量在醋酸浓度较小时，随醋酸浓度的增大，显色溶液的吸光度增加较多，醋酸浓度较大时，增大醋酸的浓度，显色溶液的吸光度增加较少。测定中1mL试液加入1mL醋酸为宜。加入醋酸还可加快显色反应速度。紫外-可见分光光度法4、显色溶剂的选择在水溶液中显色，溶液为浑浊的蓝色，并很快沉淀。试验发现加入95％乙醇，显色溶液为清彻的深蓝色，无沉淀。表明乙醇能够增大显色化合物的溶解度而使其稳定，因此采用乙醇为显色溶剂。测定中1mL试液加人2mL95％乙醇为宜。紫外-可见分光光度法5、显色温度和显色时间显色反应温度过高，溶液沸腾，使溶剂损失严重，以80℃水浴显色为宜。在该温度下显色25～30min后，显色溶液的吸光度不再增加。紫外-可见分光光度法6、显色化合物的稳定时间在拟定实验条件下，显色化合物的吸光度在显色后1h无变化，10h后，吸光度略有减小。Epstahl试剂的配制：对二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%H3PO45g，水20mL

。紫外-可见分光光度法7、样品分析称取1.000g干燥杜仲叶粉末，用60%乙醇提取3次，提取液于50mL容量瓶定容。分别吸取100μL桃叶珊瑚苷溶液和提取液，加入Epstahl试剂，80℃加热30min显色。在601nm测定吸光度，根据工作曲线计算桃叶珊瑚甙的含量。紫外-可见分光光度法3、药物中多糖的分光光度法分析1、标准曲线的制备多糖在浓HCl作用下，水解成单糖，和3,5-二硝基水杨酸缩合成有色化合物，可用分光光度法于适宜波长处测定多糖含量，本法简便，显色稳定，灵敏度高，重现性好。取葡萄糖标准品配置成一系列不同浓度的标准溶液，分别加入3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀，放入90℃水浴中加热10min，取出，流水冷却，用蒸馏水定容，摇匀，于492nm处测吸光度。得回归方程：C＝112.4942A＋36.0148,R=0.9979。式中：C—标准溶液浓度（μg/mL），A—吸光度。紫外-可见分光光度法2、提取物中多糖的含量测定精密称取多糖提取物100mg（或从材料中提取多糖），用蒸馏水定容至10mL，精密吸取0.5mL。加入6mol/L的HCl10mL，沸水浴加热水解30min，冷却后用6mol/L的NaOH调pH至中性，加入2mL3,5-二硝基水杨酸试剂，另取一支试管以蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸试剂为空白对照，充分混合后于90℃水浴中显色10min，492nm测定A值，以标准曲线计算酸性多糖的含量。紫外-可见分光光度法作用？Why?紫外-可见分光光度法原理：3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水杨酸），在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比。

三、紫外分光光度法分析利用紫外分光光度法进行定量分析具有快速、灵敏度等优点。一般测试范围在1％至0.1ppm，准确度可在2％以内。本法不需要显色剂，因而不受显色剂、温度及显色时间等因素的影响，操作简便。待测成分在紫外光区（200~400nm）有吸收，并在测试浓度范围内服从朗伯-比尔定律者，均可选用。

紫外分光光度法常用中药主成分的紫外吸收波长紫外分光光度法纸色谱分离-紫外分光光度法测阿魏酸展开剂：水洗脱剂：95%乙醇分析波长：330nm应用实例紫外分光光度法紫外分光光度法第二章光谱分析法的应用分光光度法第二章光谱分析法的应用分光光度法第二章光谱分析法的应用分光光度法第二节红外分光光度法的应用

*红外分光光度法（1nfraredSpectrophotometry）：是以红外区域电磁波连续光谱作为辐射源照射样品，记录样品吸收曲线的一种物理光学分析方法，又称红外吸收光谱法。红外光谱区一般分为三个区域，近红外光区，波长0.75~2.5μm；中红外区，波长2.5~25μm；远红外区，波长25~500μm。

红外分光光度法红外吸收光谱突出特点是具有高度的特征性，除光学异构体外，每种有机化合物都有自己的红外吸收光谱。有机化合物中各官能团在某一区域出现吸收谱带的位置相对恒定，不受或少受分子中其它部分的影响，这种谱带称为相应官能团的特征吸收，可用于有机官能团的鉴定。

第二章光谱分析法的应用红外分光光度法红外光谱主要应用在定性鉴别上，若两个样品的光谱完全相同，可以判断它们是同一化合物。若峰数不多，且外形较钝，则可靠性较差。红外光谱是整个化合物的分子鉴别，红外光谱的“指纹”区更具有鉴别化合物的特征。一、定性分析第二章光谱分析法的应用红外分光光度法1.山药2.参署3.木薯4.番薯1.山药2.参署3.木薯4.番薯第二章光谱分析法的应用红外分光光度法

利用红外分光光度计进行定量分析，它的理论基础仍然是朗伯-比尔定律。但有以下缺点。1、光源强度和检测器灵敏度比可见和紫外光谱仪小。2、吸收池是由氯化钠等组成，比较脆弱、其厚度不易确定，表面状态也经常改变。3、红外光谱中ε最大不超过103，可见和紫外吸收光谱中的ε值可达105

，红外光谱的灵敏度低。二、定量分析S-410光栅透射型近红外分光光度计傅立叶变换红外光谱仪IR200

含量测定方法:1、基线法在吸收峰两侧选基点P和Q，两点连线称为基线，通过峰顶t作垂线rs则：

由rs与ts线的长度，可求出样品在此波长下的吸收度。依次配制一系列不同浓度的样品溶液，在同样的波长下测定吸收度，绘制标准曲线，利用工作曲线求出样品的浓度。含量测定方法:2、固体样品吸收度法：最简便的方法是绘制KBr片中样品的工作曲线。设s为压片的面积，L为厚度，m为压片中样品的量，在压片中的样品浓度将为：比尔定律：同一模具压片，S为常数E/S＝k，则A＝mk。在片中，样品的吸收度只与片中样品的量有关，而与片的厚度无关。制备一系列不同含量的片，测定吸收度，而后绘制工作曲线。3、峰高法：P96第二章光谱分析法的应用第三节荧光分析法的应用

用一种波长的光（如紫外光）照射某物质时，物质的分子吸收了该波长的光后，在很短的时间内（延迟几纳秒至几微秒）发射出较照射波长长的光，即为荧光。因而荧光光谱是发射光谱。利用物质分子结构不同，所吸收的紫外光波长与发射的荧光波长也有所不同的特性，可鉴别物质。荧光分析法具有灵敏度高（浓度可低至10-4μg/m1）、选择性好、试样量少（几十微克或几十微升）等特点。

不足之处是干扰因素较多且实验条件严格。

第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法一、激发光谱与荧光光谱任何发荧光的分子都具有两个特征光谱：激发光谱和荧光光谱。*激发光谱：将激发荧光的光源（紫外光或可见光）用单色器分光，测定样品对每一波长的激发光所发射的荧光强度，以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，就可得到荧光物质的激发光谱。*荧光光谱：用选好的最大激发波长作光源，让物质发生的荧光通过单色器分光，测定每一个波长的荧光强度，以荧光强度对荧光波长作图，得荧光光谱。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法二、荧光和分子结构的关系

产生荧光的首要条件是物质分子必须具有电子吸收光谱的特征结构，其次是必须具有一定的荧光效率和合适的环境。

荧光通常发生于具有共轭双键体系的分子，体系中电子共轭度越大，非定域π电子越易被激发，就越易产生荧光，且荧光光谱将向长波长方向移动。任何有利于提高π电子共轭程度的结构改变，都能提高荧光效率、或使荧光波长红移。例如蒽：荧光效率0.36：荧光波长402nn，9-乙烯基蒽：荧光效率0.76；荧光波长432nm。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法

三、荧光强度

荧光强度与样品浓度呈线性关系，与物质本身的荧光效率及激发光强度成正比。荧光效率愈大，荧光强度愈强。激发光源愈强，产生的荧光愈强，检测灵敏度愈高。但很强的光源易使样品光分解，通常使用中等强度的激发光。化合物的摩尔吸收系数越大，其产生的荧光强度越强。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法四、测定仪器测定荧光的仪器，常用的有目测荧光计、光电荧光计和荧光分光光度计等。其基本结构都是由激发光源、单色器、样品池与检测系统组成的。

荧光分光光度计基本结构和原理图AmincoBowmanSeries2型荧光分光光度计第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法五、影响荧光强度的外界因素*1、溶剂溶剂的极性显著地影响荧光物质的荧光强度。通常溶剂极性增大，对n-π共扼的荧光物质，n-π*跃迁所需能量增加，跃迁儿率减少，荧光强度减弱，这些物质的荧光测定，宜用非极性溶剂。相反，对π-π*共扼的荧光物质，π-π*跃迁所需能量减小，跃迁几率增加，荧光强度增强。含有重原子的溶剂如四溴化碳、碘乙烷等，使化合物的荧光大为减弱，应尽可能避免使用这类溶剂。通常配制溶液时，使用的溶剂除水外，常用的还有乙醇、环乙烷、四氯化碳、氯仿等。这些溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过净化处理后方可使用。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法2、温度：

通常溶液的荧光强度随温度的降低而增强。

如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下每降低10℃、荧光效率增加3％。这主要是因为在溶液温度下降时，介质粘度增加，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞也随之减少的缘故。

随着温度的升高，荧光降低的主要原因是由于分子内的能量转移作用，即将激发能转为基态的振动能，或通过碰撞将能量转移给其它分子。另一原因可能是激发分子与溶剂分子之间发生某些可逆的光化学反应。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法3、溶液的pH

当荧光物质为带有酸或碱功能团的芳香化合物，或为金属络合物时，溶液pH值的变化将对溶液中荧光物质的荧光强度发生影响。例如苯酚是弱酸，在酸性溶液中以分子形式存在，呈现荧光，但在碱性溶液中则以苯酚阴离子形式存在，却不呈现荧光。又如镁和8-羟基喹啉-5-磺酸钠，在pH8以上时形成络合物，呈现荧光。当pH下降到5.7以下，络合物解离，荧光也消失。还有些荧光物质在酸性或碱性介质中，因水解而使荧光强度发生改变，也有的因发生环的破裂或链的断开而引起荧光强的变化。第二章光谱分析法的应用荧光分光光度法六、定量分析方法荧光分析的定量方法与分光光度法基本相同，比分光光度法灵敏度高，但精密度较差，易受系统误差的影响。常用方法有标准曲线法，直接比较法、制备荧光衍生物测定法、淬灭荧光测定法、化学发光免疫分析法、激光荧光光谱法、导数荧光光谱法等。第二章光谱分析法的应用误差及处理第四节误差及其处理误差是衡量定量分析准确性高低的一个尺度。一、绝对误差和相对误差1、绝对误差测量值(x)与真实值(μ)的差值称为绝对误差(absoluteerror)，用符号δ表示。δ=x-μ(绝对误差可正也可负，代表的意义?)2、相对误差绝对误差与真实