微生物的实验室培养(用)

到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关当前第1页\共有43页\编于星期四\17点你知道微生物可分为哪几类吗？当前第2页\共有43页\编于星期四\17点微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.当前第3页\共有43页\编于星期四\17点课题1微生物的实验室培养专题2:微生物的培养与应用当前第4页\共有43页\编于星期四\17点一、培养基作用、种类二、无菌技术三、制备牛肉膏蛋白胨培养基四、纯化大肠杆菌本课题主要内容当前第5页\共有43页\编于星期四\17点一、培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基1什么是培养基？培养基的基本成分有哪些？当前第6页\共有43页\编于星期四\17点一、培养基

一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水以及特殊营养（即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶）等。同时培养基要满足微生物对氧气及pH值的要求。培养基的基本成分当前第7页\共有43页\编于星期四\17点

液体培养基：（一般用锥形瓶盛装）

固体培养基：（一般用试管或培养皿盛装，在液体培养基的基础上再添加琼脂。）

2培养基可分为哪些种类？（1）、按物理状态分：（2）、按功能分：选择培养基：加入某种化学物质，从众多微生物中分离出所需微生物鉴别培养基：加入某种试剂，鉴别不同种类的微生物当前第8页\共有43页\编于星期四\17点液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长当前第9页\共有43页\编于星期四\17点部分实验试剂牛肉膏蛋白胨琼脂当前第10页\共有43页\编于星期四\17点固体培养基：菌落当前第11页\共有43页\编于星期四\17点什么是菌落？由单个细菌或几个细菌在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。当前第12页\共有43页\编于星期四\17点不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:

你能举几种选择培养基吗？分离固氮菌

分离自养型微生物唯一碳源为尿素的培养基分解尿素的细菌当前第13页\共有43页\编于星期四\17点1什么是无菌技术？

无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。

获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。二、无菌技术当前第14页\共有43页\编于星期四\17点3、什么是消毒？常用的消毒方法有哪些？

2、你知道无菌技术有哪些种类？使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）消毒和灭菌煮沸消毒、巴氏消毒法、化学药剂消毒。当前第15页\共有43页\编于星期四\17点4、什么是灭菌？灭菌的方法有哪些？使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌当前第16页\共有43页\编于星期四\17点5、微生物实验时要对哪些进行消毒？哪些进行灭菌？如何避免杂菌污染？对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；将培养皿、接种用具和培养基等进行灭菌。接种的过程要在酒精灯火焰附近进行；避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触。当前第17页\共有43页\编于星期四\17点（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基三、实验操作1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤有哪些？计算、称量、溶化、灭菌、倒平板当前第18页\共有43页\编于星期四\17点1.计算：物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。2.称量当前第19页\共有43页\编于星期四\17点3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL。

4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3～5套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。

5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。当前第20页\共有43页\编于星期四\17点

5.倒平板的具体操作过程是怎样的？当前第21页\共有43页\编于星期四\17点6、请思考并回答倒平板操作的讨论？（1）.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？

用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。

（2）.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。当前第22页\共有43页\编于星期四\17点3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。当前第23页\共有43页\编于星期四\17点4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。当前第24页\共有43页\编于星期四\17点（二）纯化大肠杆菌

微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1、微生物接种方法有哪些？当前第25页\共有43页\编于星期四\17点

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。2.什么是平板划线法？平板划线法如何操作？当前第26页\共有43页\编于星期四\17点平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况当前第27页\共有43页\编于星期四\17点平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况当前第28页\共有43页\编于星期四\17点（1）、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？

第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3、平板划线法的讨论当前第29页\共有43页\编于星期四\17点（2）.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。当前第30页\共有43页\编于星期四\17点4.什么是稀释涂布平板法？

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。当前第31页\共有43页\编于星期四\17点6、系列稀释操作是怎样操作的？101102103104105106

(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。

(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。

(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。当前第32页\共有43页\编于星期四\17点7、涂布平板操作是怎样进行的？(1)将涂布器浸在盛有70％的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8～10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。当前第33页\共有43页\编于星期四\17点稀释涂布平板法获取的菌落当前第34页\共有43页\编于星期四\17点固体培养基：菌落菌落是鉴定菌种的重要依据当前第35页\共有43页\编于星期四\17点细菌的菌落有鞭毛细菌：无鞭毛细菌：有荚膜细菌：无荚膜细菌：菌落光滑,S型菌落粗糙,R型大而扁平，边缘波状或锯齿状。较小较厚，边缘整齐。当前第36页\共有43页\编于星期四\17点思考：涂布平板操作讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并记录结果。当前第37页\共有43页\编于星期四\17点1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？

未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？

如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。四、结果分析与评价当前第38页\共有43页\编于星期四\17点3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？

培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。

无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。当前第39页\共有43页\编于星期四\17点

1.试管低温临时保藏

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6个月要重新接种培养后再保存）。

2.甘油管长期保藏

在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷冻箱中保存。五、课题延伸---菌种的保藏当前第40页\共有43页\编于星期四\17点芽孢:

有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。

孢子:

细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体.当前第41页\共有43页\编于星期四\17点消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;