小鼠脑组织病理总结演示文稿

小鼠脑组织病理总结演示文稿当前第1页\共有20页\编于星期三\22点优选小鼠脑组织病理总结当前第2页\共有20页\编于星期三\22点内容石蜡切片的制作冰冻切片的制作免疫组化免疫荧光HE病理相关试剂配制注意事项当前第3页\共有20页\编于星期三\22点石蜡切片的制作

取材和固定：处死动物后或者灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中。脱水和透明：梯度酒精和二甲苯浸蜡和包埋：石蜡切片制作：切片贴片：捞片，展片保存：烤片当前第4页\共有20页\编于星期三\22点冰冻切片的制作

取材和固定：灌注后立即切取组织块，并快速投入固定液中，或者处死后直接冷冻。脱水和透明：梯度蔗糖包埋：OCT，3%聚乙烯醇。切片制作：切片贴片：直接贴固定：冰冻丙酮3-5分保存：-20°C当前第5页\共有20页\编于星期三\22点灌注

0.5%戊巴比妥钠100mg/Kg麻醉小鼠，5分钟左右小鼠麻醉好，仰卧位固定四肢，用酒精棉球擦胸腹部毛，前开皮肤暴露胸部肌肉层，剑突上成V型剪开胸廓，暴露心脏，剪掉右心耳（即视野下心脏上色暗红组织），与心尖处30°角刺入左心室，37°左右生理盐水约10ml缓慢注入，冲净血液止，换4%多聚甲醛溶液（4°预冷），10-20分钟，鼠僵硬为好。当前第6页\共有20页\编于星期三\22点固定4%多聚甲醛根据不同实验需求要求石蜡切片的固定时间不同，几小时到一周。我曾用过2天，可以。冲水，固定的时间越长冲水时间越长，预防甲醛沉积。当前第7页\共有20页\编于星期三\22点取脑断头，剪开皮肤拨向两侧暴露颅骨，从枕骨大孔处沿正中线剪开露骨，用镊子掰开露骨，暴露脑组织，用弯头镊将脑组织勾出，在坐标纸上根据小鼠脑图谱取相应脑区组织，厚3mm左右。当前第8页\共有20页\编于星期三\22点脱水和透明，浸蜡石蜡切片：75%，80%，85%，90%，95%（2个），无水乙醇（2）中每个4小时-过夜，正丁醇1-2天。二甲苯（2个）20-30分钟。三个蜡，每个大于2小时。冰冻切片：固定后脱水用10%20%30%蔗糖（0.1MPBS溶）每个室温下4小时——过夜，OCT包埋，先在锡纸盒冻一层，在中间放组织，切面朝下，再用OCT将组织没过，尽量减少气泡，在液氮表面，保持小盒水平，待中心尚透明时取出，放于-80°C保存。当前第9页\共有20页\编于星期三\22点切片石蜡：冷水——温水（54°-56°）——

烤片（80°）

切好烤片后可以室温保存。冰冻：切片温度-18°—-20°

直接贴切好于冰冻丙酮中固定5分后-20°

保存。当前第10页\共有20页\编于星期三\22点固定方法注意事项1.组织块大小2cmx2cmx0.5cm2.组织标本应及时放入固定液中,切忌干涸3.组织固定后必须冲洗,除去多余的固定液4.一般固定剂温度以室温,某些病毒则须低温下处理,用丙酮-20度至-40度固定30分钟5.浓度采用10%中性甲醛或4%多聚甲醛6.固定液量是标本体积20倍7.固定时间不超过24小时当前第11页\共有20页\编于星期三\22点组化实验设计1.对常规组织切片进行仔细观察,根据可提供形态学特点,选择最佳并能反映病变的组织标本2.列出免疫组化的指标3.进行预实验(设立阳性、阴性对照)4.找出抗体的最佳修复方法、稀释度、孵育温度及孵育时间5.每张切片应表明抗体名称,防止相互混淆当前第12页\共有20页\编于星期三\22点当前第13页\共有20页\编于星期三\22点实验过程—70°考片一夜—二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个10分钟—3%双氧水阻断室温10分钟（现配现用）—抗体修复液（现配，400ml一次一个抗体盒）

微波炉高火6-7分—冷却至室温—再修复一次冷却—PBS5分×3—擦片加一抗，4°过夜当前第14页\共有20页\编于星期三\22点—第二日PBS5分×3—加二抗室温20分—PBS5分×3—DAB显色—水冲5-10分—苏木素1-3分—水冲10-15分—80%85%90%每个3分—95%（2个）无水乙醇（2个）二甲苯（2个）每个5分—中性树胶封片。当前第15页\共有20页\编于星期三\22点免疫荧光—PBS5分×3—5%BSA室温封闭1小时—加一抗，4°过夜或根据说明书时间—第二日PBS5分×3—加二抗37°孵育1小时—PBS5分×3—DAPI染色—PBS2分—丙三醇封片荧光显微镜下观察照相。当前第16页\共有20页\编于星期三\22点HE—70°烤片一夜—二甲苯3个每个10分钟无水乙醇，95%，90%，85%，80%每个5分钟—苏木素1-5分—水—盐酸酒精—水—0.5%氨水当前第17页\共有20页\编于星期三\22点—水—95%酒精2分—0.5%醇溶伊红1秒—95%酒精30秒—95%酒精，无水乙醇（3个）每个2分—二甲苯（2个）每个2分钟—中性树胶封片，吹干当前第18页\共有20页\编于星期三\22点病理相关试剂配制

4%多聚甲醛：40g多聚甲醛粉末溶于500ml水（50°左右）黄枪头加一滴1M氢氧化钠至澄清，冷却至室温，与500ml0.2MPBS混合，滤纸过滤。0.2MPB:1000ml0.2M磷酸氢二钠810ml称57.996g0.2M磷酸二氢钠190ml称5.928g蔗糖：用0.1MPBS配制生理盐水：0.85%氯化钠溶液当前第19页\共有20页\编于星期三\22点阻断液：0.3%H2O2甲醇溶液。30%双氧水2ml加入甲醇定容至200ml。（现用现配）修复液：（400ml）