西罗莫司胶囊有关物质测定方法的改进

西罗莫司胶囊有关物质测定方法的改进赵敬丹;秦峰;闻宏亮;缪天瑶;裘亚;张含智浏浩【摘要】目的改进西罗莫司胶囊现行标准中有关物质的测定方法，为合理评价其质量提供依据.方法从西罗莫司的生物合成途径及分子结构等出发预测西罗莫司主要的工艺杂质及降解杂质，通过色谱条件的筛选和优化分别建立了可同时测定开环降解杂质和工艺杂质的有关物质1分析方法并新建了单独控制氧化降解杂质的分析方法.结果新建的方法可弥补现行标准不能有效控制制剂工艺及储藏过程中可能产生的开环降解杂质和氧化物杂质的缺陷，利于企业监测产品的质量，进而提高临床用药的安全性.结论新建的有关物质测定方法专属性、耐用性和重复性良好，可更加有交攵地评价产品的质量.％ObjectiveToimprovetheanalysismethodoftherelatedsubstancesofsirolimuscapsules,andevaluatethequalityreasonably.MethodsAccordingtothebiosyntheticpathwayandthestructureofsirolimus,wepredicteditsprocessedimpuritiesanddegradationimpurities.Thecontrollingmethodswereestablishedthroughaseriesofchromatographicoptimization.ResultsThenewmethodscanmakeupthedefectionsofthedetectionandthecontrollingofdegradationimpuritiessuchastheopen-ringandoxidationproducts,whichweregeneratedduringpharmaceuticalprocessesor/andstorage.Thenewmethodswerebeneficialformonitoringthequalityoftheproducts,andimprovingthesafetyoftheclinicaltreatment.ConclusionThenewmethodsarespecific,durableandreproducible,anditcanevaluatethequalityofsirolimuscapsulesmoreeffectively.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷)，期】2018(043)003【总页数】6页(P354-359)【关键词】西罗莫司胶囊;杂质谱;断雷帕霉素;氧化物杂质【作者】赵敬丹;秦峰;闻宏亮;缪天瑶;裘亚涨含智浏浩【作者单位】上海市食品药品检验所，上海201203;上海市食品药品检验所，上海201203;复旦大学化学系，上海200433;上海市食品药品检验所，上海201203;上海市食品药品检验所，上海201203;上海市食品药品检验所，上海201203;上海市食品药品检验所，上海201203;上海市食品药品检验所，上海201203【正文语种】中文【中图分类】R978.1;R917西罗莫司(sirolimus)，原称雷帕霉素(rapamycin)，是一种采用全发酵工艺制得的亲脂性含氮三十六元大环内酯类免疫抑制剂，由美国原Wyeth公司研发，西罗莫司片(1mg)于1999年在美国首次上市。国内华北制药股份有限公司于2010年首次获准生产西罗莫司胶囊。西罗莫司临床上主要用于肾、肝等器官移植抗排斥作用。主要不良反应表现为高胆固醇血症，骨髓抑制和肝脏损害［1］。各国药典均未收载西罗莫司胶囊，现执行标准为国家食品药品监督管理局标准［2］，由于受检测技术等条件的限制，现行标准对有关物质缺乏全面系统的评价，仅限于对异构体和总杂质的控制，难以真实反映产品的质量。西罗莫司来源于微生物发酵，发酵过程中可能会产生一系列的同系物、同分异构体和互变异构体（异构体A和异构体C）等；在制剂或储藏过程中，又可能产生开环及氧化降解产物等。西罗莫司杂质谱的复杂性，要求建立系统、全面的质量控制方法，以更好地保障临床用药的安全性和有效性。本文结合西罗莫司的发酵工艺和结构特点，对西罗莫司的杂质谱进行了预测并结合样品有关物质的测定结果，对未知杂质进行了结构推断，根据生产工艺等对杂质的来源进行了分析，并建立了可同时检测工艺杂质和开环降解杂质的分析方法，解决了现有色谱系统不能有效控制开环降解杂质的问题；建立了氧化物杂质的分析方法，推断了其主要为西罗莫司共扼三烯氧化物的混合物，为更好地评价西罗莫司胶囊的质量奠定了基础。1仪器与材料仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，Agilent6550型Q-TOF质谱仪，SartoriusCP225D型电子天平。乙腈，叔丁基甲醚，三氟乙酸均为色谱纯，甲酸铵，甲酸及其他试剂均为分析纯，水为Milli-Q超纯水。西罗莫司对照品（浙江省食品药品检验研究院，批号：20151112，纯度：99.7%）；断雷帕霉素（降解产物）、10-O-去甲基西罗莫司（工艺杂质）均由辉瑞制药有限公司提供；脯氨酰西罗莫司（工艺杂质）由福建科瑞药业有限公司提供；各对照品的结构见图1。西罗莫司胶囊（国内抽样/函调样品，共5件）。2方法2.1法定标准色谱条件色谱柱：Kromasil100-5C18（4.6mmx250mm,5pm）；检测波长为277nm；流动相：以5%乙腈水溶液为流动相A,66%乙腈水溶液为流动相B；按表1进行线性梯度洗脱；流速为1mL/min；柱温50°C；进样体积20pL。图1西罗莫司的各杂质结构Fig.1Structuresofsirolimusrelatedcompounds1:西罗莫司（Sirolimus）；2:10-O-去甲基西罗莫司（10-O-demethyl-sirolimus);3:脯氨酰西罗莫司(prolylsirolimus);4:断雷帕霉素(seco-rapamycin)表1流动相梯度洗脱程序Tab.1Gradientelutionprogramofmobilephaset/minMPA/%MPB/%01000801005501005610006010002.2新建色谱条件1(有关物质1)色谱柱：Kromasil100-5C18(4.6mmx250mm,5pm);检测波长为277nm;流动相：以20mmol/L甲酸铵溶液(用甲酸调节pH值至3.8)为流动相A，乙腈(含1%的叔丁基甲醚)为流动相B;按表2进行线性梯度洗脱；流速为1.5mL/min;柱温35°C;进样体积20pL。2.3新建色谱条件2(氧化物杂质)色谱柱：ProdigyODS3(4.6mmx100mm,3pm);检测波长为240nm;流动相：以0.01%三氟醋酸为流动相A，乙腈为流动相B;按表3进行线性梯度洗脱；流速为1.2mL/min;柱温35C;进样体积20pL。表2流动相梯度洗脱程序Tab.2Gradientelutionprogramofmobilephaset/minMPA/%MPB/%04357184357252971330100430100444357524357表3流动相梯度洗脱程序Tab.3Gradientelutionprogramofmobilephaset/minMPA/%MPB/%075253015853515853675254575253结果与讨论3.1法定检验结果按法定标准，5件西罗莫司胶囊的有关物质测定结果均符合规定。但是，试验发现在法定检验标准色谱系统下，标示为2016年生产和2015年生产的西罗莫司胶囊的杂质谱，尤其是主峰前洗脱的杂质，存在明显的差异。提示：西罗莫司原料生产工艺可能存在不稳定性；西罗莫司主要开环降解产物断雷帕霉素和辅料同时洗脱，难以准确评价产品的质量。上述结果提示，需建立完善的有关物质评价体系，以全面考察生产工艺与产品的内在质量，为国内西罗莫司胶囊质量的提升提供依据。3.2有关物质分析方法的完善由于西罗莫司胶囊法定标准有关物质项未控制制剂工艺过程中及储藏过程中潜在的降解杂质，存在一定的临床安全隐患。因此，本文的重点是建立适合西罗莫司生产工艺特点的、兼顾工艺杂质和降解杂质的有关物质测定方法，为企业提高西罗莫司胶囊的质量奠定基础，进而提高临床用药的安全性。3.2.1西罗莫司杂质谱的预测西罗莫司由发酵工艺生产，其生物合成主要由合成酶RapA、RapB、RapC、RapP和RapL等参与，其合成工艺［3］如图2所示。结合西罗莫司的生物合成途径，可能存在的工艺杂质有脯氨酰西罗莫司、去甲基西罗莫司及其同系物等；由西罗莫司化学结构知，其主要降解杂质可能有开环降解杂质和氧化降解杂质等［4］。通过对各杂质的分析与预测，既为杂质分析方法的建立确立了理论基础，又可验证分析方法的完善性。3.2.2有关物质1分析方法的建立有关物质检测方法的建立，应该考虑杂质检出的全面性和有效性，以防止由于杂质研究不足导致杂质评价的缺陷。通过生物合成途径及分子结构对西罗莫司的杂质谱进行预测，有利于验证方法的完善性，也可以进一步验证方法的灵敏度和专属性。色谱系统建立的依据：通过溶解样品溶剂的筛选、柱温、流动相系统的优化(包括流动相的组成、流动相的pH、缓冲溶液的种类和浓度、流动相中改性剂的选择、互补分离模式的验证等)等试验过程，最终建立了专属性良好，可同时控制西罗莫司主要工艺杂质和开环降解杂质的液相色谱系统［5］，为西罗莫司胶囊色谱系统的建立奠定了基础。方法学考察：①专属性试验：经辅料干扰试验，酸破坏，碱破坏，氧化破坏，加热破坏和光照破坏试验知，在建立的色谱条件下，各降解物杂质均能与西罗莫司有效分离，且不干扰各已知杂质的测定，表明方法专属性良好。典型色谱图见图3。图2西罗莫司的生物合成途径Fig.2Sirolimusbiosyntheticpathway重复性：取胶囊内容物适量，共6份，分别加乙腈溶解并稀释制成约0.5mg/mL的溶液，进样分析。各杂质峰面积的RSD值均符合规定，结果表明，方法的重复性良好。线性范围：精密称取西罗莫司对照品适量，加乙腈溶解并定量稀释制成系列浓度的线性溶液。按“2.2”项下色谱条件测定，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程为：A=40.437C+6.8363,r=0.9999。结果显示，西罗莫司在0.2~50pg/mL范围内线性关系良好。检测限：以信噪比S/N=3计，西罗莫司的检测限约为2.3ng(以进样20"计)。耐用性：考察了5根不同品牌的C18色谱柱对分离情况的影响，分别为Kromasil100-5C18柱(4.6mmx250mm,5pm)、Luna5mC18(2)100A柱(4.6mmx250mm,5pm)、ZorbaxeclipseXDB-C18柱(4.6mmx250mm,5pm),TSKgelODS-100S柱(4.6mmx250mm,5pm)和ThermoSyncronisC18柱(4.6mmx250mm,5pm),供试品为西罗莫司的碱降解溶液，结果显示各降解杂质峰(如断雷帕霉素)均能和西罗莫司及其他杂质(如脯氨酰西罗莫司和10-O-去甲基西罗莫司)有效分离，说明本方法的耐用性较好。样品测定：采用新建的液相色谱分析方法对5件样品进行测定。结果表明，西罗莫司胶囊中断雷帕霉素的含量较低，色谱峰不明显，典型色谱图见图4。由于断雷帕霉素对照品难以大量制备，为了在实际样品测定时对断雷帕霉素准确定量，根据西罗莫司在碱性条件下易降解产生断雷帕霉素的现象，在方法中增加样品的碱破坏溶液作为系统适用性溶液，并结合本实验中断雷帕霉素对照品的色谱保留，以标准图谱的形式标示出断雷帕霉素。通过和杂质对照品色谱保留行为的比较及质谱裂解规律比对，以及西罗莫司在乙腈水溶液中的转化研究，确认了4个已知组分，分别为断雷帕霉素，脯氨酰西罗莫司，西罗莫司互变异构体A和10-O-去甲基西罗莫司；通过样品溶液稳定性试验研究及质谱裂解规律的推导等首次发现1个新的降解杂质，命名为9-羰基西罗莫司类似物。图3西罗莫司胶囊有关物质1专属性试验典型色谱图Fig.3HPLCchromatogramsofspecifictesta:酸破坏；b:碱破坏；c:氧化破坏；d：加热破坏；e：光照破坏；1：断雷帕霉素；2:脯氨酰雷帕霉素；3：西罗莫司异构体A；4：10-O-去甲基西罗莫司；5:西罗莫司；6:西罗莫司异构体C图4西罗莫司胶囊有关物质样品溶液典型色谱图Fig.4HPLCChromatogramsofsamplesolution1:断雷帕霉素；2:脯氨酰西罗莫司；3:西罗莫司互变异构体A；4:10-O-去甲基西罗莫司；5:西罗莫司；6:西罗莫司异构体C；7:9-羰基西罗莫司3.2.3氧化物杂质分析方法的建立氧化物杂质分析方法建立的依据：无定型西罗莫司及西罗莫司溶液均易被催化氧化，且西罗莫司溶液在放置过程中也能够被氧化，这两种氧化反应的产物基本一致，均为单氧化物或寡聚物。西罗莫司结构中的共扼三烯基团以及除半缩醛羟基以外的羟基均易被氧化［4］。如果共扼三烯参与氧化反应，则氧化物的紫外吸收特征和西罗莫司紫外吸收特征不—致，最大吸收波长约为220~240nm［4］。因此，在西罗莫司最大吸收波长处可能检测不到部分潜在的氧化降解物或检测灵敏度将大大降低。在有关物质色谱系统建立的过程中对4°C静置2个月的降解溶液(10mg/mL)，分别采用液相色谱紫外检测(UV)和蒸发光散射检测(ELSD)两种方法测定其有关物质，色谱图见图5。采用ELSD测定时，西罗莫司主峰前洗脱的部分杂质峰(图5中以A、B和C标示）的响应值明显高于UV响应值。和新制样品溶液相比，主峰后洗脱的两个杂质的响应有增加趋势，但是ELSD响应值弱于UV响应值（图5中以D和E标示），推测为其他氧化物杂质。根据两组色谱峰色谱保留行为的差异，推测主峰前洗脱的杂质可能主要为共扼三烯氧化混合物（极性增加），其质谱信息显示质量数均比西罗莫司增加16和32个单位，和推测吻合。主峰后洗脱的杂质可能主要为羟基氧化产物（极性降低），由于仍保留共扼三烯的结构特征，最大吸收波长和西罗莫司一致，其质谱信息显示质量数均比西罗莫司减少了2个单位，和推测吻合。上述结果表明：在现有的有关物质分析系统中，共扼三烯氧化物有被漏检的可能，由于该类杂质极性增加，色谱保留减弱，有必要通过调整流动相洗脱强度和色谱检测波长的方式，建立单独控制西罗莫司共扼三烯氧化物的分析方法。图5降解溶液ELSD和UV色谱图Fig.5HPLCchromatogramsofdegradationsolution（ELSDandUV）（2）氧化物杂质分析方法：参照西罗莫司片进口注册标准［6］，并经方法学考察，建立了适用于西罗莫司胶囊氧化物杂质分析的方法，色谱条件见“2.3”项。⑶样品测定结果：经质谱分析，西罗莫司主峰相对保留时间0.45-0.91（脯氨酰西罗莫司）之间的色谱峰质量数均比西罗莫司增加16或32个单位，且紫外光谱图显示其最大吸收波长均为220~240nm。因此，以西罗莫司主峰相对保留时间0.45-0.91（脯氨酰西罗莫司）之间的杂质峰作为氧化物杂质峰，采用峰面积归一化法计算氧化物杂质中单个杂质和总杂质的量。供试品溶液的典型色谱图见图6。图6供试品溶液的典型色谱图Fig.6HPLCchromatogramofsamplesolution4小结本文采用法定检验结合