七=外源基因在真核细胞中的表达与调控

外源基因在真核细胞中的表达与调控山东大学医学院免疫学研究所王晓燕当前第1页\共有180页\编于星期四\14点基因工程的基本程序

载体外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主细胞选出含有重组DNA的细胞abbAAb重组DNA的扩增或表达当前第2页\共有180页\编于星期四\14点基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。基因工程技术的核心是基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。当前第3页\共有180页\编于星期四\14点一、概述（一）几个重要的概念1、表达系统（geneexpressionsystem)：

基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化。当前第4页\共有180页\编于星期四\14点当前第5页\共有180页\编于星期四\14点2、据受体细胞的不同可分为：1）原核表达系统：

将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2）真核表达系统：

使外源基因在真核细胞中表达的体系。当前第6页\共有180页\编于星期四\14点（二）原核表达系统的局限性

1.缺乏翻译后加工修饰系统，不能进行糖基化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。2.在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解。3.很难实现真正的分泌出胞，其产量很低，而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。4.表达产物常以包涵体（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要经过变性（盐酸胍或尿素）复性（二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂），并且复性效率低。5.内毒素的污染当前第7页\共有180页\编于星期四\14点真核基因组结构复杂庞大:形成复杂的染色质或者染色体基因不连续性:内含子、外显子3.含有大量的重复序列：低度、中度或高度4.存在许多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5.没有原核细胞的操纵子，不产生多顺反子mRNA:即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链(单顺反子mRNA）。6.基因表达调控复杂（三）真核基因组结构特点当前第8页\共有180页\编于星期四\14点(a)原核生物mRNA为多顺反子(b)真核生物mRNA为单顺反子当前第9页\共有180页\编于星期四\14点当前第10页\共有180页\编于星期四\14点（四）真核基因表达调控特点——多方面、多层次1.转录前（基因组水平）调控：基因结构改变，持久且不可逆2.转录水平调控：3.转录后修饰：4.翻译水平的调控：5.翻译后修饰：当前第11页\共有180页\编于星期四\14点当前第12页\共有180页\编于星期四\14点转录前调控1.基因丢失：目前认为这种调节方式主要是在较低等的真核生物中。2.基因扩增：是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。3.基因重排：是指某些基因片段改变原来存在的顺序而重新排列组合。4.甲基化修饰：DNA甲基化是一种重要的基因组表观遗传修饰，参与调控许多细胞过程，包括胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹以及染色体稳定性。5.染色质结构对基因表达的调控：细胞分裂时松开分散在核内的染色质称为常染色质，常染色质的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质，基因不能转录表达。当前第13页\共有180页\编于星期四\14点转录水平调控1.RNA聚合酶:I,II,III2.顺式调控因子（cis-actingfactor)3.反式作用因子（trans-actingfactor)当前第14页\共有180页\编于星期四\14点酶主要转录产物RNA聚合酶ⅠrRNA，大多数snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前体，部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核细胞中RNA聚合酶的种类当前第15页\共有180页\编于星期四\14点顺式调控因子顺式调控因子（cis-actingfactor)：是与结构基因串连的、对基因转录的精确起始和转录活性具重要调控作用的特定DNA序列。包括正性调控元件（启动子、增强子）和负性调控元件（沉寂子、加尾和转录终止信号）当前第16页\共有180页\编于星期四\14点启动子启动子（Promoter）:位于基因的5'端与基因转录起始有关的核苷酸序列。一般包括转录起始点及其上游100-200bp序列作用特点：近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定分类：核心启动子元件（转录起始点上游-30bp区的TATA-box）：决定基因转录精确起始。上游启动子元件(包括：-70至-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒):协同决定转录基础效率。组织特异性元件:如肝细胞特异性启动子元件HP1，与白蛋白、AFP等基因在肝细胞中的特异性表达有关。诱导性启动子元件：如cAMP反应元件（CRE），介导对cAMP、生长因子等信号的反应。当前第17页\共有180页\编于星期四\14点

启动子结构模式图

SP1NF1

SP1TBP当前第18页\共有180页\编于星期四\14点当前第19页\共有180页\编于星期四\14点表－1哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中

常见的元件元件名称共同序列结合的蛋白因子名称分子量DNA长度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp当前第20页\共有180页\编于星期四\14点增强子增强子(Enhancer):是一类本身不具备启动子活性但能够促进转录活性的顺式调控元件。构成：由单拷贝或多拷贝组件串连构成，长100-200bp，核心组件8-12bp。作用特点：远距离作用无方向性有启动子依赖性，但对启动子无严格专一性，因而无基因特异性。组织特异性相位性当前第21页\共有180页\编于星期四\14点当前第22页\共有180页\编于星期四\14点负性调控元件沉寂子（silencer)或衰减子(dehancer)：是一类抑制基因转录的顺式调控元件，作用方式同增强子。转录终止信号：加尾信号：AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇：能形成发夹结构的反向重复序列当前第23页\共有180页\编于星期四\14点当前第24页\共有180页\编于星期四\14点反式作用因子反式作用因子（Trans-actingfactor）:由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。当前第25页\共有180页\编于星期四\14点转录信号1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA结合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB当前第26页\共有180页\编于星期四\14点反式作用因子可以分为3类：（1）普通转录因子（通用转录因子）：主要识别启动子的核心启动成分，如TATA盒结合因子TFIID；（2）组织特异性转录因子：是特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2；（3）诱导性反式作用因子：与反应性元件（responseelements）相结合的反式作用因子。如HSRE（热休克反应元件，heatshockresponseelement）

GRE（糖皮质激素反应元件，glucocorticoidresponseelement）

CRE（cAMP反应元件，cAMPresponseelement）

当前第27页\共有180页\编于星期四\14点反式作用因子的结构DNA结合域转录激活域TF富含谷氨酰胺结构域酸性α-螺旋结构域富含脯氨酸结构域同源结构域锌指结构域亮氨酸拉链螺旋-环-螺旋螺旋-转角-螺旋当前第28页\共有180页\编于星期四\14点螺旋转角螺旋锌指结构亮氨基拉链螺旋环螺旋同源结构域SP1OCT-2AP-1myc当前第29页\共有180页\编于星期四\14点当前第30页\共有180页\编于星期四\14点1、RNA加工成熟：无论是rRNA、tRNA、mRNA，转录后都必须经过加工，才能成为有功能的分子。rRNA：前体是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，还要经过化学修饰--核糖甲基化。tRNA：首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再剪接成为成熟的tRNA。mRNA：5’加帽子，3’加poly(A)，还要经过剪接以及核苷酸的甲基化修饰。转录后水平的调控当前第31页\共有180页\编于星期四\14点当前第32页\共有180页\编于星期四\14点

真核生物的基因可以分为两大类：一类是简单的转录单位；另一类是复杂转录单位。转录后加工方式是不同的。（1）简单转录单位：编码产生一个多肽，转录后加工有3种形式。a、基因没有内含子，转录后无需加工，也没有poly(A),如组蛋白基因。b、没有内含子，无需剪切，但需要加poly(A)尾，如α-干扰素基因。c、有内含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它们只产生一个有功能的mRNA，如ɑ,β-珠蛋白基因。2、转录后加工的多样性当前第33页\共有180页\编于星期四\14点当前第34页\共有180页\编于星期四\14点初级转录产物可通过不同的方式加工成两个或两个以上的mRNA。a、利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质。b、利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质。c、虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点。

（2）复杂转录单位当前第35页\共有180页\编于星期四\14点利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质当前第36页\共有180页\编于星期四\14点当前第37页\共有180页\编于星期四\14点利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质当前第38页\共有180页\编于星期四\14点虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点当前第39页\共有180页\编于星期四\14点翻译水平的调控对可溶性蛋白质因子的修饰：如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白质的合成。对mRNA稳定性的调节反义RNA对翻译的调控作用反义RNA(anti-sense)：一段含有与被调控基因所产生mRNA互补的碱基序列的小分子RNA。①与mRNA结合，形成双链RNA。影响mRNA的模板效率；②可能参与mRNA的拼接。当前第40页\共有180页\编于星期四\14点当前第41页\共有180页\编于星期四\14点1.多肽的切割：切去前端的信号肽2.多肽的有限水解：蛋白质（酶原）必须经过有限的酶和化学水解才能变成有活性的物质。3.多肽的化学修饰：蛋白质磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙酰化。4.多肽的剪接：多肽被剪接成数个片段，再以一定的顺序结合起来，形成有活性的蛋白质。翻译后的调控当前第42页\共有180页\编于星期四\14点二、真核表达系统真核表达系统（Eukaryoticexpressionsystem)：指在真核细胞中表达外源基因的体系。

组成：真核表达载体受体细胞基因转移方式当前第43页\共有180页\编于星期四\14点（一）真核表达系统的必要性和优势1.具有转录后加工系统：剪除内含子2.具有完善的翻译后加工系统：对表达蛋白进行修饰，具有天然构型。3.可实现分泌表达:将表达产物分泌至细胞外培养液，简化了纯化工艺。4.有助于深入了解真核基因表达调控机制,实现基因治疗。当前第44页\共有180页\编于星期四\14点（二）真核表达载体真核表达载体：适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。真核载体根据受体不同，可分为：酵母表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫杆状病毒表达载体。当前第45页\共有180页\编于星期四\14点

真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。真核表达载体中还具有：①真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、polyA加尾信号等②真核细胞复制起始序列③真核细胞药物抗性基因当前第46页\共有180页\编于星期四\14点真核表达载体带有的polyA加尾信号可保证新转录的mRNA能有效地加上polyA。真核表达载体的基本组成

OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列PolyA当前第47页\共有180页\编于星期四\14点（三）真核表达系统1.酵母表达系统：利用酵母表达载体，在酵母细胞中表达外源基因2.哺乳动物细胞表达系统：利用重组质粒或病毒载体，在哺乳动物细胞内表达外源基因3.昆虫细胞表达系统：利用昆虫杆状病毒表达载体，在昆虫细胞内表达外源基因当前第48页\共有180页\编于星期四\14点

酵母表达系统

当前第49页\共有180页\编于星期四\14点特点及优势

酵母菌是单细胞真核生物，其遗传背景清楚培养简单，生长周期短，经济生物安全性高可分泌表达，简化纯化工艺当前第50页\共有180页\编于星期四\14点（一）酵母载体在酵母细胞中复制、扩增和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。主要组成元件：筛选标记：如抗生素抗性基因Zeocin(博来霉素,属于争光霉素家族的成员）营养缺陷标记基因Leu(β异丙基苹果酸脱氢酶,参与丙酮酸向亮氨酸的转化)

当前第51页\共有180页\编于星期四\14点

Leu-作为酵母载体的选择标记基因当前第52页\共有180页\编于星期四\14点用于酵母载体中的调控序列ARS（AutoReplicationSequence)：自主复制序列，为酵母复制起始区(点)。2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。酵母启动子：常用的有GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、AOX1（醇氧化酶-1）、ADH(乙醇脱氢酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(碱性磷酸酶)启动子。酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性。当前第53页\共有180页\编于星期四\14点酵母载体的种类酵母克隆载体：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如YIP、YRP、YEP酵母表达载体：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体YAC：酵母人工染色体（yeastartificialchromosome)可插入200～800kb的外源基因片段，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。当前第54页\共有180页\编于星期四\14点1.YIp(酵母整合型质粒)：细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。2.YRp(酵母复制型质粒)：细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差。3.YEp(酵母附加子型质粒)：细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制。I.酵母克隆载体当前第55页\共有180页\编于星期四\14点

酵母克隆载体的构建当前第56页\共有180页\编于星期四\14点II.酵母表达载体含酵母启动子穿梭载体(shuttlevector)：既可以携带外源基因在原核细胞中复制增殖，又可以在真核细胞中表达外源基因的载体。种类：酿酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体分泌型表达载体：引入酵母的信号肽基因，如因子信号肽当前第57页\共有180页\编于星期四\14点酿酒酵母表达载体Leu2编码β异丙基苹果酸脱氢酶，作为筛选标记。带有此质粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培养基中能生长。当前第58页\共有180页\编于星期四\14点毕赤酵母表达载体整合型HIS4编码组氨醇脱氢酶基因，作为筛选标记。HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使营养缺陷型宿主恢复野生型，在不含组氨酸的培养基上能生长。当前第59页\共有180页\编于星期四\14点5‘AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志；3‘AOX1基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组；抗Amp基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件当前第60页\共有180页\编于星期四\14点毕赤酵母分泌型表达载体启动外源基因的启动子：PGAPPTEF1PEMT，MCS：多克隆位点鉴定的标记：6╳His，myc.终止子：AOX1TT，CYC1TT抗生素筛选标记：zeocin.复制起始位点：pUCori当前第61页\共有180页\编于星期四\14点III.酵母人工染色体（YAC）YAC:利用酵母的着丝粒序列（CEN）、酵母复制起始区（ARS）及端粒重复序列（TEL）构建的人工染色体结构：左臂：TEL、选择标记、ARS、CEN右臂：TEL、选择标记特点：容量大（200-800kb），稳定性差作用：构建基因组文库当前第62页\共有180页\编于星期四\14点

YAC载体中最常用的是pYAC4筛选标记:His3:组氨酸合成缺陷性标记URA3:尿嘧啶合成缺陷性标记SUP4:赭石突变(ade2-1)抑制基因sup4当前第63页\共有180页\编于星期四\14点当前第64页\共有180页\编于星期四\14点（二）受体细胞1、酿酒酵母：它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。当前第65页\共有180页\编于星期四\14点表1-3在酿酒酵母中表达的重组蛋白种类名称疫苗乙肝病毒表面抗原，疟原虫环子孢子蛋白，HIV－1外壳蛋白诊断试剂丙肝病毒蛋白，HIV－1抗原人类治疗用蛋白药物上皮生长因子，胰岛素，类胰岛素生长因子，血小板源生长因子，胰岛素前体，成纤细胞生长因子，集落刺激因子，α1抗胰蛋白酶，凝血因子XⅢa当前第66页\共有180页\编于星期四\14点2、毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞高表达（12mg/L）：AOX1启动子或GAP启动子高稳定性：载体为整合型高分泌（10mg/L）：因子信号肽基因

在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。当前第67页\共有180页\编于星期四\14点（三）转化①锂盐法；②PEG法；③原生质球法；④电穿孔法。

电穿孔法：效率较高,应用最广整合型载体转化前要酶切线性化当前第68页\共有180页\编于星期四\14点（四）外源基因在酵母菌中的表达1、胞内表达：直接表达外源基因

2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列pGAPZ,利用因子分泌表达当前第69页\共有180页\编于星期四\14点当前第70页\共有180页\编于星期四\14点当前第71页\共有180页\编于星期四\14点人Endostatin基因的克隆、表达中国人胎肝总RNAEndostatincDNApGEM-T载体T-A克隆RT-PCR重组endostatin克隆载体pGAPZaA载体重组endostatin表达载体电转化GS115毕赤酵母菌ZeocinSDS阳性重组子当前第72页\共有180页\编于星期四\14点当前第73页\共有180页\编于星期四\14点重组Endostatin的初步纯化与抑制作用研究阳性重组子大量扩增、表达endostatin蛋白培养上清超滤浓缩SepharoseG25去盐Heparin亲和层析初步纯化的重组endostatin蛋白浓缩液透析抑制作用研究体外作用ECV304细胞HepG2.2.15细胞体内作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管当前第74页\共有180页\编于星期四\14点（五）高表达的策略1.利用诱导型强启动子2.提高整合拷贝数3.控制蛋白酶降解活性4.分泌表达当前第75页\共有180页\编于星期四\14点（六）缺点不能实现全部的翻译后修饰功能当前第76页\共有180页\编于星期四\14点哺乳动物细胞表达系统当前第77页\共有180页\编于星期四\14点优点进行完全的翻译后修饰可表达产生有功能的膜蛋白用途：表达大量的外源蛋白研究基因的功能基因治疗

有效选择转化细胞，要求载体具备明显的标记基因当前第78页\共有180页\编于星期四\14点（一）几种常用的哺乳动物表达系统的选择标记基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰转移酶基因检测系统5、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因当前第79页\共有180页\编于星期四\14点1、胸苷激酶（tk）基因胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。当前第80页\共有180页\编于星期四\14点tk+细胞中：胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氢叶酸二氢叶酸还原酶

四氢叶酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻断补加次黄嘌呤（H）死亡存活补救合成当前第81页\共有180页\编于星期四\14点胸苷激酶(tk)基因HAT选择法原理携带外源基因的载体连接有tk基因，可以表达胸苷激酶以tk－细胞为受体细胞在HAT（次黄嘌呤－氨基喋呤－胸苷）选择培养基中，只有外源基因转化成功的tk+细胞存活，tk-细胞死亡则阳性重组子在HAT中筛选出来当前第82页\共有180页\编于星期四\14点2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因二氢叶酸二氢叶酸还原酶

四氢叶酸

TTPdCTPdATP

氨基蝶呤氨甲喋呤阻断当前第83页\共有180页\编于星期四\14点二氢叶酸还原酶基因筛选法原理

携带外源基因的载体连接有dhfr基因，可以表达二氢叶酸还原酶以dhfr-细胞为受体：CHO细胞dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。若在培养基内加入氨甲蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量。当前第84页\共有180页\编于星期四\14点3、新霉素抗性基因(neo)新霉素的类似物G418（gentamycin）对原核、真核细胞均有毒性。携带外源基因的载体连接有neo基因，neo编码的磷酸转移酶可灭活G418，因而，只有转化入neo基因的细胞才能够在含有G418的培养基中存活。此种筛选方法要求载体携带neo基因，而对受体细胞无要求，应用更为简便。当前第85页\共有180页\编于星期四\14点4、氯霉素乙酰转移酶基因检测系统

氯霉素乙酰转移酶（Cat）是由大肠杆菌转座子Tn9编码的。Cat可催化氯霉素发生乙酰化作用，使其实去活性。虽然真核细胞不含有内源性的Cat酶活性，但真核细胞的启动子可引发外源性Cat基因的表达。当前第86页\共有180页\编于星期四\14点以Cat基因作为选择标记的原理将带有Cat基因的质粒载体转化到哺乳动物细胞后，就会合成Cat。哺乳动物细胞本身不能合成Cat，所以只要在转化的细胞中检测到Cat的活性，即可肯定它是来自外源的Cat质粒。特别适用于瞬时表达的研究。当前第87页\共有180页\编于星期四\14点5、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因XGPRT是由大肠杆菌Ecogpt基因编码的一种核苷酸代谢酶，哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤核苷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤核苷酸（IMP）。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。当前第88页\共有180页\编于星期四\14点黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）

基因筛选法原理将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行。加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。当前第89页\共有180页\编于星期四\14点当前第90页\共有180页\编于星期四\14点（二）外源基因导入哺乳动物

细胞的载体质粒型(非病毒型)载体病毒型载体当前第91页\共有180页\编于星期四\14点启动子：病毒来源的：SV40、CMV、RSV细胞来源的：HSP、MCK（肌酸激酶）增强子:来源于SV40、RSV、CMV（在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力）筛选标记原核序列：复制子及筛选标记真核复制起始点：提高外源基因表达水平转录终止信号和多聚腺苷酸化信号

哺乳动物细胞表达载体的主要元件当前第92页\共有180页\编于星期四\14点1.质粒型载体由真核复制信号、启动子、转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。当前第93页\共有180页\编于星期四\14点当前第94页\共有180页\编于星期四\14点BGH：BovineGrowthHormone当前第95页\共有180页\编于星期四\14点pVAX1的特点不仅具有在大肠杆菌中高拷贝复制和在多数哺乳类动物细胞中高效表达蛋白的特点,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人体内产生变应反应者较少。pVAX1是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于pVAX1的研究已涉及动物和临床试验。当前第96页\共有180页\编于星期四\14点当前第97页\共有180页\编于星期四\14点pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：

①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；

②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；

③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；

④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

当前第98页\共有180页\编于星期四\14点GFP的相关知识：

绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)基因来源于JellyfishAequoreaVictoria，是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。

当前第99页\共有180页\编于星期四\14点与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：

①在荧光显微镜下，用波长约490nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；

②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；

③蛋白本身性质稳定；

④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；

⑤其基因片段长度较小(约717bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。

当前第100页\共有180页\编于星期四\14点EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。

当前第101页\共有180页\编于星期四\14点2.病毒型载体外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制(多需辅助病毒或包装细胞的存在)。如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等当前第102页\共有180页\编于星期四\14点病毒型载体的类型整合型整合入宿主染色体，随染色体复制而复制可持续表达外源基因安全性低：插入诱变SV40载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺相关病毒载体游离型不整合生物安全性高瞬时表达腺病毒载体，痘苗病毒载体当前第103页\共有180页\编于星期四\14点SV40(猴空泡病毒40)载体dsDNA病毒，基因组约5.2kb基因结构清楚,含有整套基因表达调控序列早期区：T、t抗原（肿瘤蛋白质或抗原）T抗原是细胞转化的启动所必须的。t抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。

晚期区：产生病毒衣壳蛋白（VP1，VP2及VP3)，包装病毒颗粒所必需复制起始位点：早、晚区基因之间当前第104页\共有180页\编于星期四\14点当前第105页\共有180页\编于星期四\14点特点载体构建：早期取代晚期取代天然SV40载体宿主范围窄，容量小（2.5kb）易形成野生型病毒溶源生长：导致宿主细胞裂解死亡故较少使用，做瞬时转染用（转化COS细胞），或利用其调控元件。pSV系列由SV40派生的一系列质粒型载体当前第106页\共有180页\编于星期四\14点当前第107页\共有180页\编于星期四\14点当前第108页\共有180页\编于星期四\14点逆转录病毒载体(RV)

基因组结构：ssRNA(9.2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR（longterminalrepeat）:长末端重复序列,含启动子和polyA信号,介导病毒整合。φ包装信号：是包装病毒颗粒时所必须的非编码序列。结构蛋白：核心蛋白(gag)、逆转录酶（pol)、衣壳蛋白(env)。当前第109页\共有180页\编于星期四\14点当前第110页\共有180页\编于星期四\14点逆转录病毒穿梭载体pLXSNMCS当前第111页\共有180页\编于星期四\14点载体元件：LTR、标记基因及质粒部分组成逆转录病毒载体系统包括：一个含有目的基因的表达载体；一个编码VSV-G（疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G，是一种包膜蛋白，具有广泛的宿主范围）的辅助质粒；表达gag/pol的辅助质粒；293T（人胚肾细胞）包装细胞。

当前第112页\共有180页\编于星期四\14点优点：宿主范围广，能感染多种动物和人类的不同类型的细胞而无严格的组织特异性；逆转录病毒载体能够高效地感染分裂的宿主细胞，感染细胞后能够将载体基因组稳定整合到宿主基因组的随机位点上，使目的基因长期稳定表达。逆转录病毒的免疫原性较低。缺点：只能感染分裂细胞，而不能感染非分裂细胞；能够插人的外源基因较小(7～8kb)，难以满足较大基因的转移；载体DNA整合人宿主染色体是随机的，并因随机整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，从而具有引发癌症的风险；

当前第113页\共有180页\编于星期四\14点目的基因

RV穿梭载体

包装细胞系重组RV载体E．coli大量扩增病毒载体DNA重组逆转录病毒颗粒受体细胞

表达蛋白，研究宿主细胞性状克隆共转染感染转化辅助质粒筛选、扩增当前第114页\共有180页\编于星期四\14点

慢病毒载体（lentivirus）属逆转录病毒亚属，是一类非鼠源性逆转录病毒，以人类免疫缺陷病毒（HIV）为代表。慢病毒源性载体（lentivirus-basedvector，LV）：能将外源基因整合入非分裂细胞的基因组内。无明显免疫反应，长期的转基因表达。具有严格的宿主范围、滴度低及HIV-1独特的致病性，限制了它作为转基因载体的应用。主要应用于转染神经元，效果好于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。

当前第115页\共有180页\编于星期四\14点当前第116页\共有180页\编于星期四\14点腺相关病毒载体（AAV）腺相关病毒：Adeno-AssociatedVirus，AAV线状单链DNA病毒，4.7kb，缺陷型非病原性人类细小病毒，只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。感染细胞范围广，可感染分裂期与分裂后期细胞野生型病毒可定点整合人类19号染色体长臂，基因表达稳定;

当前第117页\共有180页\编于星期四\14点缺点外源基因插入容量小（5kb以下）感染效率比逆转录病毒低制备滴度低存在一定的免疫反应主要应用于转染骨骼肌、视网膜、肝细胞、神经元细胞等当前第118页\共有180页\编于星期四\14点腺病毒（Ad）载体基因结构：dsDNA,线性，36kbφE1A

E1BL1E3E2AE2BE4Φ：包装信号E1—E4:结构蛋白当前第119页\共有180页\编于星期四\14点载体构建：取代结构基因特点：安全性高(人为自然宿主，不整合)滴度高（1011pfu/ml）容量大（--36kb)可感染非分裂细胞可直接体内应用，原位感染组织是目前基因治疗的最常用载体缺点：免疫原性高，表达时间短无组织特异性真核细胞内筛选复杂，费时当前第120页\共有180页\编于星期四\14点AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下优点：1.效率高：可以感染分裂期与静止期细胞2.筛选方便：带有目的基因的穿梭载体与病毒骨架质粒的同源重组发生于原核细胞（如细菌）内。3.生物安全性高：不整合4.插入容量大当前第121页\共有180页\编于星期四\14点AdEasy-1system包括：腺病毒穿梭载体：可连接外源基因骨架质粒：含有腺病毒大部分结构基因的质粒，pAdEasy-1受体细胞：E.coliBJ5183包装细胞：转入E1或E4基因区的HEK293（人胚肾细胞）或911细胞（人胚视网膜细胞）当前第122页\共有180页\编于星期四\14点穿梭载体当前第123页\共有180页\编于星期四\14点当前第124页\共有180页\编于星期四\14点痘苗病毒载体容量大安全性好：长期用作预防天花的疫苗可用来构建多价疫苗

当前第125页\共有180页\编于星期四\14点常用的病毒载体的特点：当前第126页\共有180页\编于星期四\14点（三）受体细胞1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）可稳定表达外源基因，并可大规模生产药物、抗体及诊断试剂，被美国FDA确认为基因工程受体细胞。2、COS细胞（猴肾细胞系）能瞬时大量表达外源蛋白，是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主细胞。3、其他细胞：如肿瘤细胞Hela(人宫颈癌细胞）等。当前第127页\共有180页\编于星期四\14点（四）重组载体导入细胞的方法当前第128页\共有180页\编于星期四\14点1.病毒感染：借用病毒的感染方式，将外源基因事先插入到病毒的基因组中，并用适当的方式包装成有感染活性的重组病毒颗粒，用于感染细胞，从而将外源病毒导入到相应的细胞中。常用：逆转录病毒；腺病毒；疱疹病毒等。优点：整和效率高,可使外源基因在宿主细胞中长期表达,适用于难以转染的原代细胞。缺点：重组病毒建立有一定难度；存在潜在的安全危险性。当前第129页\共有180页\编于星期四\14点目的基因

AdV穿梭载体

包装细胞HEK293

重组AdV载体E．coli

BJ5183同源重组阳性的腺病毒基因组载体DNA重组rAd病毒颗粒受体细胞

表达蛋白，研究宿主细胞性状克隆转染感染骨架质粒共转染转化E．coli

扩增转化Ecoli扩增当前第130页\共有180页\编于星期四\14点图1：复制缺陷型重组腺病毒载体制备原理图图2辅助病毒依赖型腺病毒载体制备示意图当前第131页\共有180页\编于星期四\14点2.转染：外源DNA导入到细胞中的非病毒方法，通常称为转染。分化学方法和物理方法。理想的转染方法：操作简单、高效、低毒、对细胞正常生理状况影响小、重复性好、成本低。磷酸钙共沉淀法阳离子脂质体转染受体介导的基因转移电穿孔显微注射基因枪当前第132页\共有180页\编于星期四\14点Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression当前第133页\共有180页\编于星期四\14点磷酸钙共沉淀法磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合,氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和,形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面,借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。当前第134页\共有180页\编于星期四\14点磷酸钙共沉淀法的优缺点优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物,瞬时转染和稳定转染。缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核,其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达。重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。当前第135页\共有180页\编于星期四\14点脂质体介导基因转移法中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。

当前第136页\共有180页\编于星期四\14点带正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。当前第137页\共有180页\编于星期四\14点脂质体介导方法的优缺点优点：适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞,可用于瞬时转染和稳定转染；转染效率高,比磷酸钙法高5-100倍；能够把ＤＮＡ和ＲＮＡ转染到各种细胞,转染的稳定性好,可重复性高,转染时最好不加血清和抗生素。缺点：阳离子脂质体细胞毒性相对较高,对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。当前第138页\共有180页\编于星期四\14点受体介导的基因转移

配体寡肽E5针对细胞表面受体（IGFRI，II）HA20流感病毒血凝素功能域20肽，作为内吞小体释放寡肽多聚阳离子多肽PCP多聚赖氨酸（PL）携带外源基因的质粒DNA当前第139页\共有180页\编于星期四\14点质粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20：破坏溶酶体膜E5：特异性导入肝癌细胞吞噬溶酶体当前第140页\共有180页\编于星期四\14点电穿孔介导基因转移法

靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞.

当前第141页\共有180页\编于星期四\14点电穿孔法的优缺点优点：转染效率较高缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大,每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化.

当前第142页\共有180页\编于星期四\14点其它方法显微注射：借助显微注射器直接把DNA注入核内,使之整合入受体细胞基因组中.优点：转染效率高,可用于瞬时转染和稳定转染。缺点：导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射,不适合大量转染。基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内.

当前第143页\共有180页\编于星期四\14点基因体内治疗方法exvivo途径：即体外细胞介导法，通过移植携带靶基因的工程细胞完成目的基因转移，是基因转移技术和脑内移植技术的结合。特点：经典、安全，效果较易控制，但是存在操作步骤多、技术复杂、难度大及若采用人类胚胎细胞则涉及伦理学问题。

invivo途径：即体内直接转染法，是体内基因治疗的直接途径，操作简便、易推广，但方法尚不成熟、未能解决疗效短、免疫和安全问题。包括非病毒介导途径与病毒载体介导途径。

当前第144页\共有180页\编于星期四\14点目的基因靶细胞体外扩增工程细胞或基因修饰的细胞筛选鉴定脑内靶区Minipump分泌营养因子，神经递质，酶

移植

当前第145页\共有180页\编于星期四\14点基因的体内直接转移方法非病毒类载体介导途径：通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。1）裸DNA2）脂质体(Liposome)介导：Lipid/DNAcomplex3）基因枪：基因枪是一种专门用于基因转移的高压枪,可以把平均直径约为4μm的钨等金属粒子射入细胞中,若将目的DNA附着在金属粒子表面,就可以实现基因的直接转移。

4）电转移法：体内电转移是适用于向各种组织和器官转运基因的一种物理方法,而且成本低、最易实现、安全性高,其效率还可通过改善靶组织的生物扰动性、质粒DNA的结构和编码蛋白的设计来提高。当前第146页\共有180页\编于星期四\14点病毒类载体介导途径：将无复制能力含外源基因的重组病毒直接应用于患者体内。虽然病毒载体作为基因传递的工具已广泛采用,但病毒性载体仍存在着不少的局限性:如均可诱导机体产生某种程度的免疫反应,具有插入突变致瘤、致毒的风险,载体的容量有限,制备滴度不高等。

当前第147页\共有180页\编于星期四\14点

瞬时转染：外源基因导入到哺乳动物细胞后1～4天，就可以检测到基因的表达情况。表达完全由导入的质粒来执行，绝大多数质粒没有整合到染色体上而被降解或随细胞分裂而丢失。永久转染：导入的基因整合到细胞的染色体DNA中。

（五）外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式当前第148页\共有180页\编于星期四\14点（六）哺乳动物细胞表达系统的缺点需要组织培养筛选时间长价格昂贵当前第149页\共有180页\编于星期四\14点昆虫细胞表达系统当前第150页\共有180页\编于星期四\14点优点具有真核细胞的翻译后修饰功能；

正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；

高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；

可表达非常大的外源性基因（～200kD）；

具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；

对脊椎动物是安全的。当前第151页\共有180页\编于星期四\14点(一)昆虫杆状病毒载体1、昆虫杆状病毒许多农林业昆虫的天敌，对人无寄生能力，安全性高。基因组特点：Baculivirus基因组庞大具复制非必需区，可用于改造为基因工程载体（多角体蛋白编码序列、P10蛋白序列）当前第152页\共有180页\编于星期四\14点当前第153页\共有180页\编于星期四\14点2、杆状病毒载体转移载体

转移载体（transfervector):同时含有原核序列(复制起始信号、抗性基因)和病毒基因组序列的载体,除可携带外源基因在原核中复制、扩增外，还可通过细胞内同源重组，将外源基因插入病毒基因组，构建重组病毒。当前第154页\共有180页\编于星期四\14点基本元件原核序列：ori、抗性基因杆状病毒启动子杆状病毒复制非必需区MCS当前第155页\共有180页\编于星期四\14点当前第156页\共有180页\编于星期四\14点（二）受体细胞1、sf（秋粘虫）细胞2、Bm（家蚕）细胞3、昆虫幼虫当前第157页\共有180页\编于星期四\14点（三）以杆状病毒为载体表达目的基因的流程图

当前第158页\共有180页\编于星期四\14点三、基因表达产物的检测基因转录水平检测NorthernBlot、RT-PCR蛋白翻译水平检测ELISA、WesternBlot生物活性检测根据表达产物特性进行设计当前第159页\共有180页\编于星期四\14点当前第160页\共有180页\编于星期四\14点RNA干扰将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。当前第161页\共有180页\编于星期四\14点

siRNA诱导干扰复合体(siRNAinducedinterferencecomplex,RISC),依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA2dependentRNApolymerase,RdRP)当前第162页\共有180页\编于星期四\14点RNAi研究的一般技术路线当前第163页\共有180页\编于星期四\14点当前第164页\共有180页\编于星期四\14点

各种siRNA制备方法比较比较项目

化学合成siRNA

DNA载体shRNA

Lentiviral-shRNA

siRNA结构

双链RNA或发夹结构RNA

发夹结构RNA

发夹结构RNA

RNA干扰持续时间

<72小时

<10天

>30天

适合的细胞系

转染效率大于70%的细胞

转染效率大于20%

但是可以传代的细胞

几乎所有细胞

单次制备费用

低

中

高

重复使用费用

中

低

低

是否可自行扩增

不可以

可以

不可以

构建稳定表达siRNA

的细胞株

不满足

满足，但有风险

满足，可以同时制备

多种稳定表达细胞系

组织特异性干扰实验

不满足

满足

满足

干细胞分化实验

不满足

不满足

满足

裸鼠荷瘤实验

低重复性

低重复性

高重复性

转基因knockdown实验

不满足

不满足

满足

当前第165页\共有180页\编于星期四\14点SiRNA的一般设计原则（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议不要针对5'和3'端的非编码区（untranslatedregions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST。（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

当前第166页\共有180页\编于星期四\14点转染细胞siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但是其转染效率只有10%，那么总的抑制率只有9%。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。但是有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的RNAi研究。当前第167页\共有180页\编于星期四\14点阴性对照一个完整的siRNA实验应该有阴性对照。可以确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的RNAi的结果。作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

当前第168页\共有180页\编于星期四\14点阳性对照和空白对照阳性对照应该选用针对看家基因（GAPDH、ACTB）的siRNA进行实验，以确认这条实验途径是可行的。空白对照不等于阴性对照，空白对照是不加siRNA的结果。当前第169页\共有180页\编于星期四\14点RNAi的效果分析可从mRNA和蛋白质两方面进行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern杂交等。蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。当前第170页\共有180页\编于星期四\