ＤＮＡ的粗提取与鉴定

5.1DNA的粗提取与鉴定单位：哈32中学作者：夏炎人教（PEP）课标版选修一生物技术实践学习目标：1、说出DNA的物理和化学性质。2、概述DNA的粗提取和鉴定的原理。3、尝试对动物或植物组织的DNA进行粗提取。4、培养学生协作意识和合作能力。一、基础知识：1、提取生物大分子的基本思路是什么？2、你所知道的生物大分子有哪些?3、对DNA进行粗提取的基本思路是什么？（一）DNA的溶解性：1、请根据曲线图思考下列问题：（1）在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。（2）如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？

DNA和蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出2、DNA在酒精溶液中的溶解性如何？DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离（二）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性如何？1、蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响2、

高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才会变性3、洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对DNA没有影响（三）DNA的鉴定方法是什么？试剂：二苯胺条件：沸水浴现象：DNA与二苯胺反应呈现蓝色。

二、实验设计（一）实验材料的选取：

1、什么样的材料适合提取DNA？2、下列的材料中适合做DNA的提取吗？为什么？你打算选用哪种材料？请说出理由鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、动物细胞讨论：①鸡血细胞液如何制备？为什么选鸡血红细胞，而不选哺乳动物的红细胞？②为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2、植物细胞讨论：①加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？②如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？3、滤液/研磨液中可能含有哪些成分？（三）除去滤液中的杂质1、方案一中为什么反复地溶解与析出DNA，能够除去杂质？2、方案二和方案三的原理有什么不同（四）DNA的析出与鉴定1、DNA的析出思考：使用冷却的乙醇有意义是什么？2、简述DNA的鉴定的过程实例：以鸡血细胞液为例简述DNA的提取和鉴定的步骤1、制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）500mL中注入0.1g/mL柠檬酸钠100mL+新鲜鸡血180mL，玻璃棒搅拌5min，放入冰箱1d，吸去上清液；2、破碎细胞，释放DNA取血细胞5-10mL＋20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌1min,过滤,收集滤液；3、溶解细胞核内的DNA滤液＋2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌，使DNA充分溶解4、DNA的析出在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现（析出）丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L），过滤，收集黏稠物5、DNA初步纯化DNA的黏稠物+20mL2mol/L的NaCl溶液，轻缓搅拌3min，过滤，向滤液中+体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。6、DNA的鉴定⑴两支试管中分别加入2mol/LNaCl溶液5ml⑵其中一支试管中加入DNA丝状物⑶各加入二苯胺试剂4ml⑷混匀后，置于沸水浴中加热5min⑸冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化，观察现象7、实验小结：1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、操作提示1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺要现配现用，否则会影响鉴定效果。四、课题延伸：

本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。练习：

1．（2017•常州模拟）在DNA粗提取与鉴定实验中，将获得的含有DNA的黏稠物分别按下表处理3次，则DNA主要集中在标号（）A．①③⑤ B．②③⑤ C．①④⑥ D．②④⑥【解答】解：（1）由于DNA可以溶于氯化钠溶液中，在2mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度较高，搅拌过滤后，DNA存在于得到滤液②，而黏稠物①只含有少量DNA而可以丢弃；（2）DNA在O.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，此时DNA会从溶液中析出，搅拌过滤后，得到黏稠物③主要就是DNA，因此滤液④可以丢弃；（3）由于DNA不溶于酒精，而其它杂质可以溶于酒精，因此放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌过滤后，DNA存在于黏稠物⑤中，滤液⑥可以丢弃．故选：B．2．（2017•盐城一模）下列有关用鸡血进行DNA粗提取和鉴定实验的操作，错误的是（）A．鸡血细胞中加入蒸馏水后，用玻棒搅拌B．用蛋白酶纯化溶解于2mol/LNaCl溶液中的DNAC．在溶有DNA的滤液中加入体积分数为95%的冷酒精后，用玻棒轻缓搅拌D．将卷在玻棒上的丝状物加入到4mL二苯胺试剂中，沸水浴加热，冷却后观察答案：D3（2017•扬州模拟）下列关于DNA粗提取与鉴定的实验叙述，正确的是（

）A．酵母、菜花和猪血均可作为提取DNA的材料B．由于DNA对高温耐受性差，故提取时需加入95%的冷酒精C．可用木瓜蛋白酶纯化过滤后研磨液中的DNAD．向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中缓缓加蒸馏水，当出现析出物时停止加水答案：C4．洗涤剂能够瓦解（），但对DNA没有影响。A.细胞壁B.细胞膜C.细胞核D.细胞质5．在沸水浴的条件下，DNA遇（）会被染成蓝色。A.斐林试剂B.苏丹Ⅲ染液C.双缩脲试剂D.二苯胺6．在DNA提取过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是（）A.不易破碎B.