普通遗传学基因工程和基因组学

普通遗传学基因工程和基因组学第一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日重组DNA技术第二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第一节基因工程概述遗传研究要阐明遗传与变异的现象和基本规律，探索遗传与变异的原因及其物质基础。在此基础上：解释、研究生物进化的原因、过程和规律(遗传与进化)改善动、植物和微生物的遗传特性——按照人类的意愿，创造、培育各种生物的新类型、新品种的人工进化过程(育种学)。育种工作的理论和技术水平在很大程度上取决于遗传学所取得的成就。迄今为止，动、植物育种的绝大部分成就都是以经典遗传、细胞遗传和数量遗传理论为基础所取得的。第三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日遗传工程的基础人类对自然改造的能力取决于对自然规律的认识水平。分子遗传、生物化学及分子生物学、细胞生物学的理论和技术发展使生物遗传操作的能力正在不断提高遗传工程的理论与技术基础主要来自于：1.分子遗传学的理论2.生物化学及分子生物学的理论与技术3.细胞生物学理论和技术第四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日遗传工程的含义生物技术生物工程：遗传工程蛋白质工程、酶工程微生物工程遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程2.细胞工程3.基因工程狭义的遗传工程指的是基因工程第五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

生物技术(biotechnology)

又称生物工艺学,生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分,进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。第六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

细胞工程(cellengineering)应用细胞生物学的原理和方法,结合工程学的技术手段,按照人们预先的设计,有计划地改变或创造细胞遗传性的技术,以及在体外大量培养和繁殖细胞,或获得细胞产品,或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。第七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日植物细胞工程第八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日酶工程(enzymeengineering)又称酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性，结合现代的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品以及利用重组DNA技术定向改变酶，进行酶的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。第九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日蛋白质工程(proteinengineering)是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作，通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法，合成基因,改造基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。第十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日一、基因工程的概念（geneticengineering）1、定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。

2、目的:

生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。第十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状（分子水平上的操作）某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能（细胞水平上的表达）3、重要特征：第十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日二、基因工程技术的诞生

1、基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因、分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了1972～1973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。第十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日2、基因工程技术的诞生第十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

第一个重组体的构建

1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”

标志着基因工程技术的诞生。第十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第一个重组体构建第十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

第一个有功能重组体的构建虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题为“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。第十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日三、基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库4、培养转化细胞，以扩增DNA重组分子，使其整合到受体细胞的基因组中5、目的基因表达分/合成切接转增检第十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日体外操作与细胞内表达第十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1、DNA片段的获得:从基因所在的生物体直接取得提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；

人工合成DNA片段（DNA合成仪）利用PCR（polymerasechainreaction）反应特异性地扩增所需要的目的基因片段，mRNA反转录成cDNA（RT-PCR)用机械的方法:超声波第二十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日首字母：大写：细菌属名2-3字母：小写：细菌种名如EcoRⅠ4字母:大写:菌株

Ⅰ，Ⅱ…:分离到的次序工具酶

限制酶（restrictionenzyme）：限制性内切酶

Ⅰ类：限制和修饰作用

Ⅱ类：识别DNA内部位点、切割双链1、分类：根据酶结构、作用及DNA结合和裂解的特性2、命名：第二十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第二十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

（2）产生平末端(bluntend):3、酶的识别和切割位点:通常4-6bp,具有回文结构(palindrom)（1）产生粘性末端(stickingend)5＇-末端:EcoRⅠ:5＇-GAATTC-3＇

3＇-CTTAAG-5’3＇-末端:PstⅠ:5＇-CTGCAG-3＇

3＇-GACGTC-5＇

SmaⅠ:5＇-CCCGGG-3＇

3＇-GGGCCC-5＇第二十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日5、同尾酶(isoaudamers):

识别序列不同,但产生相同的粘性末端

BamHⅠ:GGATCC

Sau3AⅠ:NGATCN4、同功异源酶(isochizomers):

来源不同,识别和切割位点相同如:BamHⅠ和BstⅠ第二十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日限制性内切酶限制酶第二十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日切割产生平齐末端（bluntends），如SmaI：第二十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日产生粘性末端（stickyends）：如BamHI、PstI：

识别特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome），又称反向重复序列，从两个方向阅读其序列相同的序列。第二十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第二十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

大肠杆菌中第一个发现，MW109KD

方向：5＇3＇还具有5＇

3＇及3＇

5＇外切酶活性.

缺口平移法标记DNA时常用修饰酶

对DNA或RNA末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶。1、DNA聚合酶第二十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

方向：5＇

3＇作用：以RNA为模板合成DNA，构建cDNA文库2、逆转录酶（reversetranscriptase）将3＇-OH与5＇-P连接形成3＇,5＇-磷酸二酯键3、T4DNA连接酶（T4DNAligase）第三十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日4、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）6、TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶

去除DNAorRNA5＇-P，制备载体时可防止载体自身连接，提高重组效率。5、末端脱氧核苷酰转移酶：末端转移酶作用：在DNA的3＇-OH上，加上dNTPPCR扩增第三十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日内切酶、碱性磷酸酶、连接酶的作用第三十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。第三十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建

细胞内总DNA的提取分离程序第三十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。第三十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。第三十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：

（1）作为模板的DNA序列；

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。第三十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日PCR的基本反应步骤：1、变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链；2、退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；3、延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。第三十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段第三十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日PCR仪离心机第四十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日GenomeDNATotalRNA第四十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——

费时费事 内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因第四十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日2、DNA片段和载体的连接—重组体DNA载体：细菌中的质粒、温和噬菌体重组体DNA：载体DNA+引入的DNA粘性末端平整末端连接酶第四十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第四十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第四十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日载体（vector）：将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。DNA片段+适合的载体DNA重组DNA，在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。第四十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日①具有复制原点，能自我复制；②具多克隆位点(multiplecloningsite，MCS或polylinkerregion)，即有多种限制酶的切点；③选择时的遗传标记，如抗生素基因；④易从宿主细胞中回收。载体的条件：第四十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。2．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。3．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点

细菌质粒pUC18第四十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

pUC18质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出-半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆。4．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒5．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。第四十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日λ噬菌体

◆

λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌体载体可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。

第五十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日柯斯质粒

◆柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因◆可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。还与YAC克隆系统结合，用于基因作图分析。

第五十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日穿梭载体

穿梭载体(shuttlevectors)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。

第五十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(parE，parA,parB)所必须的最少序列。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。细菌人工染色体第五十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日细菌人工染色体第五十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

酵母人工染色体◆酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）是另一类酵母穿梭载体。同Yep载体一样具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。

第五十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日Ti质粒及其衍生载体

第五十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日◆

Ti质粒具有五个主要功能区域，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。◆

T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeats)，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。◆

Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。

Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作.

Ti质粒特点第五十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日3、重组体DNA引入受体细胞受体:大肠杆菌、真核细胞转基因生物（transgenicanimals）：接受了外源基因，发生了性状改变的生物克隆（clones）、无性繁殖系:基因文库（genelibrary）第五十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第五十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。基因文库（library）：第六十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。第六十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

基因组DNA文库 存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G－文库。第六十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

cDNA文库

用细胞总mRNA

制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称

c－文库。

第六十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

一般克隆基因的检查和鉴定方法

琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力

——不同迁移率分子量标准参照物

酶切和电泳方法第六十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法

DNA杂交直接鉴定第六十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日4、选择基因(转化受体细胞和转化子的筛选)核酸分子杂交（molecularhybridization）：遗传学方法：筛选转化菌；α互补免疫学方法：蛋白质原位分子杂交：PCR方法：探针（probes）:根据所需基因的核苷酸顺序制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记。第六十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第六十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（SouthernBlot）。通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基因的存在及大小。Southern杂交第六十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日Northern杂交

也称为Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。因与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，故被趣称为Northern杂交。第六十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日原位杂交细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。

细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。第七十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日Western(印迹)杂交

蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂交相对应，称为Western杂交。常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。第七十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日Southernblottingwesternblotting第七十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日SDSPCR检测第七十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日5、目的基因的表达

目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5’端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序。则该目的基因就可以表达，从而使基因工程得以实现。第七十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日基因工程的技术组合第七十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第七十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日四、基因工程的基础与应用第七十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日全球转基因作物种植面积年份19961997199819992000面积1701100278039904420年份2001200220032005面积5260587081109000（单位:公顷）第七十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日4种主要转基因作物种植情况（2005年）

作物

大豆

棉花

油菜

玉米面积（公顷）54409804602120占同类作物%60%28%18%14%第七十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日改变花色的转基因矮牵牛花第八十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日转入荧光素酶蛋白基因的发荧光烟草第八十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日转基因甜椒第八十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日转基因西红柿第八十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日蓝色玫瑰一直是人类美丽的梦想基因工程正在将它变为现实第八十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日转基因与转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。第八十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第二节基因组学Genomics第八十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日基因组学（genomics）这一名词是美国人T·H·Rodehck在1986年7月创造出来的，与一个新的杂志genomics一道问世。基因组学完全改变只能研究单个基因的状况，它着眼于研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息。基因组学就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能的科学。一、基因组学的概念及范畴第八十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日基因组学包括3个不同的亚领域：结构基因组学(structuralgenomics)功能基因组学(functionalgenomics)比较基因组学(comparativegenomics)基因组学概念第八十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日二、结构基因组学结构基因组学(structuralgenomics)是通过人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)的实施来完成的。HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和物理图，最终完成人类和其它重要模式生物全部基因组DNA序列测定，因此HGP属于结构基因组学范畴。第八十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

二十世纪人类的“三大计划”曼哈顿原子弹计划阿波罗登月计划人类基因组计划第九十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日曼哈顿原子弹计划第九十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

我国进行的氢弹实验第九十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日阿波罗登月计划第九十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日宇航员登上阿波罗飞船第九十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日阿波罗飞船外形第九十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第九十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日月球车第九十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组计划HGP也称人类基因测序计划，主要目标是完成对人的基因组的所有碱基序列的测定，阐明人体中全部基因的位置、结构、功能、表达、调控方式及致病突变的全部信息。基本任务是完成遗传图、物理图、序列图和转录图。人类基因组包括24条染色体，3×109bp，3-4万个基因。第九十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1986年，美国杜伯克在《科学》上撰文，号召大家联合起来，从整体上把人类的基因组搞清。

1990年10月，经5年的辩论以后，美国国会终于批准被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划。第九十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组计划的目标人类基因组计划是一项国际性的研究计划。它的目标是通过以美国为主的全球性的国际合作，在大约15年的时间里完成人类24条染色体的基因组作图和DNA全长序列分析，进行基因的鉴定和功能分析。人类基因组计划的“科学产品”将是一个人类遗传信息数据库，将是一本指导人类进化的“说明书”。人类基因组计划的最终目标就是确定人类基因组所携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成的人类基因组的全部DNA序列。第一百页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日与人类登月计划相比，HGP的资金投入少，但它对人类生活的影响都可能更深远。随着这个计划的完成，DNA分子中储藏约有关人类生存和繁衍的全部遗传信息将被破译，它将帮助我们理解人类如何作为健康人发挥正常生理功能，还将最终揭示严重危害人类健康疾病的机理。第一百零一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1、HGP的主要任务遗传图谱物理图谱序列图谱转录图谱第一百零二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日遗传图谱（geneticmap）又称连锁图谱(linkagemap)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。遗传图谱-孟德尔的“新生”

第一百零三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日遗传作图：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。遗传图距单位为厘摩（cM）。遗传图有特征性的位置标记用于表示基因组中特定顺序所在的位置。遗传作图的标记有基因标记和DNA标记两类。第一百零四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人基因组全长约3300cM，如两个标记之间相距1cM，则需3300个标记，如相距2～5cM，则需660～l650个标记。标记可以是体质性状，也可以是可检出的DNA序列，例如基因、限制片段长度多态性（RFLP）和特定的单一序列等。每一个标记都要用专一序列位点（STS）作鉴定。STS是指其位置及核苷酸序列均已知的、人基因组中只有一份拷贝的DNA短片段（一般长200～500碱基对）。可用STS来确定这些DNA片段的定位与取向。第一百零五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日DNA遗传标记1、RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态性)。DNA序列上的微小变化，可能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。第一百零六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第一百零七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第一百零八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

SSLP是一些长度不等的重复序列、有多个等位基因位点。多次重复序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTR)：也称微随体(minisatellite)，重复序列长度为几十个核苷酸。简单重复序列(simpletandemrepeats，STRs)：又称为小随体(microsatellite)，常只有2~4个核苷酸重复单位。利用STR作为标记更为普遍：

STR分布在整个基因组中，而VNTR主要集中在染色体末端；

STR的PCR检测速度更快、准确性更高，因为STR长度通常在300bp以下，而VNTR相反。2、简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymor-phisms，SSLP)：第一百零九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日3、单核苷酸的多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）SNP：是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。第一军医大学2003年分子生物学

第一百一十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日基因组合中单个核苷酸的突变称为点突变，理论上每个核苷酸位置最多只有4种形式，即A,T,C,G。某些群体在特定的单核苷酸位置只有2个或3个SNP，这些位点称为双等位（biallele）或三等位（triallele）。据估计，人类基因组中位于基因内部的SNP超过200000，基因外部的点突变是基因内部的10倍，总数在3000000左右。第一百一十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

家系分析法：分析8个家系134个成员（186个减数分裂），根据5264个STR(简单重复序列)标记绘制而成。（X染色体分析是利用12家系170个成员（105个减数分裂））。将5264个标记定位在2335个位点，构建的人类基因组遗传图谱密度为每个标记599kb。人类基因组遗传图谱的构建：第一百一十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日物理图谱（physicalmap）是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。物理作图：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组合实际位置。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。物理图-路标与路轨第一百一十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日限制性作图：是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。依靠克隆的基因组作图：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理连锁图。荧光标记原为杂交：将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记所在位置。顺序标签为点左图：通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组DNA区段中。物理作图的方法有4类：第一百一十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段(序列标签位点，sequence-taggedsite,STS)为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。STS是基因组中任何单拷贝的长度在100～500bp之间的DNA序列，与核酸内切酶识别序列相关联。得到5套以上包含相关染色体或整个基因组的DNA片段是建立STS物理图的先决条件。然后，可以通过拼接而得STS物理图。第一百一十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这2个片段彼此重叠。两个STS标签在基因组上靠得近，它们就会一致同时出现在DNA大片段上；两个STS标签在基因组上相距较远，它们同时出现在一个DNA大片段上的几率就会小得多。物理图的主要内容是建立相互重叠连接的“相连DNA片段群”。只要有一定数量的STS标签，所有DNA大片段在该染色体或基因组中的位置都能被确定。第一百一十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日第一百一十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类部分染色体物理图谱第一百一十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

以EST（expressedsequencetag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5'或3'端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500bp左右。转录图-生命的乐谱第一百一十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

对基因转录表达产物mRNA互补的cDNA（其片段称为表达序列标签，EST）进行大规模测序是序列标签位点的主要来源，并以此构建人类基因组转录图（基因图）。第一百二十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日获得各类组织或细胞的基因表达谱，从而给出人体200余种基本组织或不同细胞组成的人体基因图(bodymap)。转录图（基因表达谱）研究所提供的信息，使人们有可能系统地全面地从mRNA水平了解特定细胞、组织或器官的基因表达模式并解释其生理属性，深入认识细胞生长、发育、分化、衰老和疾病发生的机制。第一百二十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组的序列图-重中之重人类基因组的核苷酸序列图(humangenomesequence)是分子水平上最高层次的、最详尽的物理图。测定总长约lm、由30亿个核苷酸组成的全序列。人类所拥有的基因位点都是相同的，不同种族、不同个体的基因差异(人类基因组的多样性)以及“正常”与“疾病”基因的差异，只是同一位点上的等位基因的差异。第一百二十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组与其他动物基因组在染色体水平上有“共线”(即同源)现象。人类第21号染色体HSA21位点与小鼠第16号染色体MMUl6，MMUl7和MMUl0连锁图的比较，两者之间存在着广泛的同源性。人类基因组计划所提供的人类核酸序列图，蕴藏了决定我们生、老、病、死的所有遗传信息，将成为人类认识自我、改造自我－使人类健康长寿的知识源泉，为21世纪现代生物学和医学奠定了基础。第一百二十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日3、大规模基因组测序

Megabace测序仪3700测序仪第一百二十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日大规模测序基本策略逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera公司）第一百二十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日运用计算机软件进行序列拼接第一百二十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类单倍体基因组含30亿碱基对(bp)的DNA序列。编码序列约占3%，非编码序列约占97%。包括约4～10万个基因，分布于22条常染色体和X、Y性染色体。第一百二十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日5、我国对人类基因组计划的贡献1994年，我国HGP在吴旻、强伯勤、陈竺、杨焕明的倡导下启动，最初由国家自然科学基金会和863高科技计划的支持下，先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”；1998年在国家科技部的领导和牵线下，1998年在上海成立了南方基因中心；1999年在北京成立了北方人类基因组中心；1999年7月在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1％。第一百二十八页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日6、HGP进展与未来整个完成的时间提前到了2003年，比原计划提前了两年。而原订于2001年完成的人类基因组的基本构图也提前一年，在2000年6月26日由美国总统克林顿与英国首相布莱尔联合宣布完成，这一天也因此成为人类历史上“值得载入史册的一天”。后基因组计划，即功能基因组计划的开始。第一百二十九页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日2000年2000年6月26日，美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯、塞莱拉公司的董事长兼首席科学家克莱格·文特尔、美国总统克林顿、英国首相布莱尔联合宣布人类基因组工作草图绘制成功。此后，人类基因组研究进入绘制“完成图”的阶段。与“框架图”相比，“完成图”的覆盖率从90％扩展到100％，准确率从99％上升到99.99％。第一百三十页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因组草图基本信息由31.65亿bp组成含3~3.5万基因与蛋白质合成有关的基因占2%人类基因组人类蛋白质61%与果蝇同源43%与线虫同源46%与酵母同源第一百三十一页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日2001年2001年2月12日，参加绘制人类基因组图谱的美、英、日、法、德、中6国科学家公布了更加准确、清晰、完整的人类基因组图谱，并指出人类基因总数只有3~3.5万个,编码序列占2%。2001年7月10日，中国“人类基因组计划”重大项目秘书长杨焕明教授宣布：在人类基因组完成图的绘制工作中，中国已率先超额（1.13%）完成所承担的任务。第一百三十二页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日2003年4月14日，6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，HGP的所有目标全部实现。覆盖人类基因组所含基因区域的99%，精确率达到99.99%，比原计划提前两年多，耗资27亿美元。并公开研究数据和结果，赢得了这场竞赛。2003年第一百三十三页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1、人类基因组中只有1%是编码序列。2、外显子只约占每条基因的5%，因此基因组中只有25%的序列是来自基因的外显子加内含子。3、人类基因组只有30000-40000条基因。4、约60%的人类基因是可变剪接的。5、多达80%的可变剪接改变了蛋白质序列，因此蛋白质组约有50000-60000个蛋白质成员。6、重复序列占人类基因的50%。人类基因组测序结果显示：第一百三十四页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日人类基因的平均长度为22kb，平均有9个外显子，而这9个外显子总共约长1340bp，因此，编码序列平均只占基因长度的5%。因为存在可变剪接，所以基因的总数比潜在的蛋白质数目少。人类和黑猩猩在DNA序列上相差非常小（序列相似性大于99%），因此，虽然基因极其相似，但它们的功能和一组相似基因的相互作用显然能够产生极不相同的结果。第一百三十五页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

水稻的基因组

2002年4月5日我国科学家完成了水稻基因组定序和初步分析。出人意料的是，水稻的基因竟比人类基因还要多得多。人类基因大约有3-4万个，水稻有46022-55615个基因。因此水稻基因组可说是继人类基因组之后，完成定序的最大基因组，也是至今已知最大的植物基因组。由于水稻是全球半数以上人口的主食，对解决全球粮食问题具有重要意义。第一百三十六页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日

由于以人类为对象的研究实际上受到诸多限制，也受伦理学的约束，所以人类基因组计划还将对有关的模式生物，如酵母、线虫、果蝇、小鼠、拟南芥等进行研究，为人类的基因组研究提供重要的依据。模式生物基因组研究第一百三十七页，共一百五十七页，编辑于2023年，星期日1996年，完成酵母菌基因组测序。1998年12月，宣告完成线虫