细胞工程及其应用详解演示文稿

细胞工程及其应用详解演示文稿当前第1页\共有72页\编于星期四\7点（优选）细胞工程及其应用当前第2页\共有72页\编于星期四\7点一、细胞工程（Cellengineering）定义是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，以获得某种有用的物质的过程。第一节细胞工程的基本概念与技术当前第3页\共有72页\编于星期四\7点所涉及的主要技术有：细胞与组织培养技术细胞融合技术细胞拆分技术染色体工程胚胎工程等等二、细胞工程的基本技术当前第4页\共有72页\编于星期四\7点1、细胞培养技术细胞培养技术：是指使动物、植物在体外无菌、适温和丰富的营养条件下分裂、生长的一门技术。一般是将有机体内的某一组织取出，经处理使其分散成单个细胞，并接种到培养基中进行培养，使细胞生长、分裂。当前第5页\共有72页\编于星期四\7点植物细胞培养当前第6页\共有72页\编于星期四\7点2、细胞融合技术细胞融合技术（cellfusiontechnology）：是指通过人工方法使遗传性状不同的原生质体（除去细胞壁的细胞）相互接触后发生融合，导致染色体等遗传物质重组并形成新物种或新品种的技术，又称体细胞杂交。当前第7页\共有72页\编于星期四\7点细胞融合的优点:克服种属间杂交的“不育性”，可进行远缘杂交基因重组频率高，重组类型多。可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个细胞中可以是两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子当前第8页\共有72页\编于星期四\7点生物学法：仙台病毒（HVJ）法。化学融合剂法：聚乙二醇（PEG）法。电处理融合法：利用细胞融合仪。促进细胞融合的方法:当前第9页\共有72页\编于星期四\7点细胞融合的基本过程:主要过程包括三方面:1、制备原生质体原生质体：指那些已去除细胞壁的细胞，细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。2、诱导细胞融合3、筛选融合子（来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的融合重组子）当前第10页\共有72页\编于星期四\7点当前第11页\共有72页\编于星期四\7点当前第12页\共有72页\编于星期四\7点当前第13页\共有72页\编于星期四\7点Zimmermann教授的燕麦原生质体的融合图像

当前第14页\共有72页\编于星期四\7点第二节动物细胞工程及其应用一、动物细胞培养是将动物细胞或组织从机体取出，分散成单个细胞，并给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞在体外继续生长和增殖的过程。在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。当前第15页\共有72页\编于星期四\7点动物细胞工程概述动物细胞工程动物细胞培养

动物细胞融合单克隆抗体制备应用胚胎移植核移植当前第16页\共有72页\编于星期四\7点动物细胞培养基本概念培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等原代培养：单个细胞传至十代左右传代培养：经原代培养的细胞可传40到50代。细胞株：10到40、50代的细胞，遗传物质没发生改变。细胞系：超过50代的细胞，遗传物质发生改变，可无限增殖。当前第17页\共有72页\编于星期四\7点二、动物细胞培养基天然培养基：直接采用动物体液或从动物组织中提取成分作为培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。合成培养基：主要是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等，一般都加入一定量的血清。无血清细胞培养基:成分有基础培养基和替代血清的补充因子（胰岛素、转铁蛋白、生长因子和激素等）。当前第18页\共有72页\编于星期四\7点当前第19页\共有72页\编于星期四\7点当前第20页\共有72页\编于星期四\7点动物细胞培养过程胚胎成幼龄动物的组织器官（细胞来源）单个细胞原代细胞细胞株细胞系剪碎胰蛋白酶分离细胞洗涤、稀释、分离原代培养传代培养（遗传物质没有发生改变）（遗传物质发生改变）当前第21页\共有72页\编于星期四\7点动物细胞培养应用生产有价值的蛋白质制品，（如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体、动物激素）检测有毒物质用于某些器官移植当前第22页\共有72页\编于星期四\7点动物细胞融合仙台病毒丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）紫外线物理法化学法生物法当前第23页\共有72页\编于星期四\7点融合过程示意图当前第24页\共有72页\编于星期四\7点单克隆抗体的概念单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强当前第25页\共有72页\编于星期四\7点实验目的:制备单克隆抗体.实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。实验材料：小白鼠实验器材：培养皿、针筒等等。实验过程：如下页根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的。其实验方案:当前第26页\共有72页\编于星期四\7点单克隆抗体制备过程当前第27页\共有72页\编于星期四\7点简要介绍单克隆抗体的制备过程

1、免疫动物

免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。当前第28页\共有72页\编于星期四\7点2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。简要介绍单克隆抗体的制备过程

当前第29页\共有72页\编于星期四\7点3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。简要介绍单克隆抗体的制备过程

当前第30页\共有72页\编于星期四\7点4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。简要介绍单克隆抗体的制备过程

当前第31页\共有72页\编于星期四\7点5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。简要介绍单克隆抗体的制备过程

当前第32页\共有72页\编于星期四\7点(2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。简要介绍单克隆抗体的制备过程

当前第33页\共有72页\编于星期四\7点简要介绍单克隆抗体的制备过程杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一、筛选出杂交瘤细胞;二、在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。当前第34页\共有72页\编于星期四\7点当前第35页\共有72页\编于星期四\7点大规模生产单克隆抗体流程当前第36页\共有72页\编于星期四\7点单克隆抗体的应用主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。当前第37页\共有72页\编于星期四\7点因无细胞壁，大多数动物细胞需附着在固体或半固体表面才能生长对营养要求较苛刻，除了需要与微生物、植物细胞一样的培养基成分外，一般需要血清或动物激素对环境更敏感，培养条件的控制更严格生长缓慢，培养时间较长，对反应器要求要长时间适应无菌状态培养。动物细胞培养的特点：当前第38页\共有72页\编于星期四\7点三、动物细胞培养方法1、悬浮培养法2、贴壁细胞培养法3、固定化细胞培养贴壁细胞培养法－微载体培养当前第39页\共有72页\编于星期四\7点生产疫苗生产生物活性物质动物干扰素、人体干扰素、人的单克隆抗体、免疫球蛋白、生长激素等的生产。基因工程细胞培养食品：美国和荷兰科学家成功培养出人造肉四、动物细胞大量培养的应用当前第40页\共有72页\编于星期四\7点附：动物细胞培养的产物

疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等

动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂β-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等当前第41页\共有72页\编于星期四\7点思考与探究：如何用细胞培养技术，为烧伤病人植皮？

取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植当前第42页\共有72页\编于星期四\7点一、植物细胞培养的理论依据及研究进展1、理论依据：细胞学说:认为植物和动物都是由细胞构成的，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体。并指出如果所具备的条件能同在活体内的一样，每个细胞都应能独立生存和发展。植物细胞具有全能性的学说:认为每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。第三节植物细胞工程及其应用当前第43页\共有72页\编于星期四\7点2、进展（与食品有关部分）：二十世纪80年代，利用植物细胞培养技术工业化生产各种生物制品已陆续投放市场。目前，全世界已对近千种植物进行过细胞培养研究，并且采用大规模植物细胞培养生产其代谢产物，包括药品、香料、色素、食品和化妆品等共500多种。当前第44页\共有72页\编于星期四\7点培养基中的物质可以概括为五类：（1）无机营养：各种盐类（大量元素和微量元素）。（2）有机营养：主要有糖类、氨基酸和维生素。（3）植物生长激素：生长素类和细胞分裂素两类。（4）天然附加物：植物的天然汁液、琼脂糖等。（5）水（一）植物细胞培养基二、植物细胞培养的技术和方法当前第45页\共有72页\编于星期四\7点植物细胞工程的发展历史植物细胞工程技术的研究始于1902年德国植物学Haberlandt,至今已有近百年历史。它的发展分为如下几个阶段：探索阶段(1902-1929年)技术建立阶段(1930-1940年)器官形成和个体发生阶段(1941-1959年)技术迅速发展阶段(1960-现在)当前第46页\共有72页\编于星期四\7点探索阶段（1902—1929年）1902年，Haberlandt根据细胞理论大胆地提出：高等植物的体细胞，可以不断分割，直至单个细胞的理论。预言体细胞在适宜条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。为了论证这一观点，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培养单个离体细胞，所选用的材料是小野芝麻和风眼兰的表皮细胞、叶栅栏组织、表皮细胞、毛、刺细胞等。遗憾的是，虽然在栅栏细胞中他明显看到了细胞的生长、细胞壁的加厚和淀粉的形成等，但没有一个细胞在培养中能够发生分裂。

当前第47页\共有72页\编于星期四\7点1904年，Hannig在添加有无机盐和有机成分的培养基中，培养萝卜和辣根的幼胚，得到了充分发育的胚并提前萌发成小苗。这是离体培养的第一个成功例子。1922年，Kotte和Robbins离体培养根尖cm的豌豆、玉米、棉花茎尖、根尖培养成苗。1925年，Laibach培养亚麻种间杂交幼胚获得成功并得到杂种（近年在远缘杂交或不能形成种子的植物上用得最多，熟称胚挽救）。当前第48页\共有72页\编于星期四\7点探索阶段取得的成果自Haberlandt的实验之后，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物离体培养技术几乎没有什么进展，只是在以下两个方面进行了一些初步的探索：一个方面是胚培养的实验，1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成热。后来，Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；另—方面是根培养的实验，1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功，这是有关根培养的最早的实验。当前第49页\共有72页\编于星期四\7点技术建立阶段（1930—1940）1933年，李继侗将3mm以上的银杏胚培养成功。同时发现加入胚乳汁可以促进离体胚的生长。1934年，Gautberet培养三毛柳、黑杨的形成层，成功地得到愈伤组织。培养基是Knop液加葡萄糖、酵母提取物、水解酪蛋白的固体培养基。同年（1934年），White将番茄根尖细胞离体培养，得到一个活跃分裂的单细胞无性系。这个无性系一直培养到20世纪60年代（共30多年）。1937年，White发现B族维生素、吲哚乙酸对植物生长的促进作用。发明了第一个人工合成培养基。1937-1938年，Nabecourt使胡萝卜根组织经培养而获得愈伤组织并继代培养了几十年。1939年，White培养烟草的形成层获得愈伤组织。同时使愈伤组织继代培养获得成功。这一阶段，人们对培养细胞的分裂和不分裂的原因尚不能解释，但在李继侗银杏幼胚培养中，由于加入胚乳汁而促进了幼胚发育的启迪下，人们开始注意到离体培养条件下的营养需要。当前第50页\共有72页\编于星期四\7点器官形成和个体发生阶段（1941—1959）1941年，Overbeek等以椰子乳汁作为培养基补加物，使曼陀罗心形期幼胚培养成功。1946年，罗士韦将菟丝子茎尖培养成功并在试管内开花。从此给人们以启迪，离体培养技术可以控制花芽的形成。1948年，Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官发生的研究中，发现腺嘌岭和腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用而诱导芽形成。生长素和腺嘌岭的比例是控制芽或根形成的重要条件。1951年，Nitsch将果实、子房、未受精的胚珠、以及花器官的各个部分培养成功。当前第51页\共有72页\编于星期四\7点1953年，Muir将万寿菊和烟草的愈伤组织，转移到液体培养基中，放在往复式摇床上振荡，获得由单细胞或细胞聚集体组成的细胞悬浮液，而且可以继代繁殖。这是培养方式的突破。1956年，Miller为了寻找细胞分裂物质，发现了激动素(6-糠基氨基瞟岭)。同时发现激动素代替腺嘌呤促进生芽，其效果增加3万倍。1958年，Steward和Shantz用胡萝卜根韧皮部细胞悬浮培养，从中诱导出胚状体并使其发育成完整小植株。第一次证实Haberlandt提出的细胞全能性学说。当前第52页\共有72页\编于星期四\7点技术迅速发展阶段（1960—现在）1960年，Cocking用纤维索酶和果胶酶溶解了番茄根尖的细胞壁，得到了原生质体。继续培养原生质体，可重新长壁、分裂、分化形成根和芽，最终形成植物体。1960年，Kanata、RanganWamy和Mahshwari培养罂粟未受精的胚珠并在试管内撒播花粉，成功地获得能正常发芽的种子。1964-1966年，Guha和Maheshwan培养毛叶曼陀罗的花药，得到由花粉发育来的单倍体植株。当前第53页\共有72页\编于星期四\7点1972年，Carlson在培养两个不同种的粉蓝烟草(Nicotianaglanca)和郎氏烟草(N.langsdorfii)原生质体时，加入诱导剂(甘露醇、盐类)，使两种原生质体发生融合，得到了细胞杂种，而且该细胞杂种经细胞分裂、分化形成完整的杂种植物。随后由加籍华人高国楠在聚乙二醇(PEG)的诱导下，使大豆和粉蓝烟草(科间)融合成功，而且得到3％的异核体。单离培养异核体2—3个月，可分裂出几百万个细胞。1974年，Bonne和Eriksson成功地完成了细胞器(叶绿体)的摄入。将具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体，在聚乙二醇诱导下融合成功。观察到16％的活胡萝卜原生质体中，含1至多个叶绿体。试验证明原生质体是引入外源遗传物质的极好材料，为基因工程奠定良好基础。当前第54页\共有72页\编于星期四\7点（二）、植物细胞培养方法按培养对象分：单细胞培养、单倍体细胞培养和原生质体培养按培养基分：固体培养和液体培养按培养系统分：悬浮培养和固定化细胞培养当前第55页\共有72页\编于星期四\7点1、

植物细胞悬浮培养技术

悬浮细胞培养是指把游离的单细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行的增殖培养。在悬浮培养中，应使细胞增殖速度快、有效成分含量高、分散程度大，游离细胞尽可能的多，利于细胞增殖和产物的生成。需要进行植物悬浮细胞系的建立。

当前第56页\共有72页\编于星期四\7点

①优良的愈伤组织的获得

（1）、

植物悬浮细胞系的建立是植物悬浮细胞体系建立的关键。愈伤组织：是指由外植体（离体植物材料如芽等）组织的增生细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞。（可传代的未分化的细胞团）。胡萝卜的愈伤组织菠萝的愈伤组织从草坪草愈伤组织再生出新的植株。

当前第57页\共有72页\编于星期四\7点获得愈伤组织的过程：选择合适的植物材料表面消毒无菌条件下切取外植体固体培养基上培养长出愈伤组织分割愈伤组织固体培养基上进行继代培养优良的愈伤组织：颗粒细小、疏松易碎、细胞生长快、有效成分含量高。当前第58页\共有72页\编于星期四\7点植物细胞脱分化、再分化图成熟细胞分生细胞多细胞团(愈伤组织)胚胎发生器官分化完整植株RedifferentiationDedifferentiation当前第59页\共有72页\编于星期四\7点愈伤组织叶基叶基在脱分化菠萝的脱分化当前第60页\共有72页\编于星期四\7点愈伤组织不定芽再生菠萝的再分化当前第61页\共有72页\编于星期四\7点生根菠萝的再分化当前第62页\共有72页\编于星期四\7点菠萝再生植株叶的培养当前第63页\共有72页\编于星期四\7点影响植物细胞脱分化和再分化因子影响因子渗透压酸碱度温度湿度光照无机盐类有机物类植物激素天然复合物环境条件培养基的组成（营养条件）内因外因遗传特性生理状态当前第64页\共有72页\编于星期四\7点完整植株的形成外植体脱分化体细胞胚愈伤组织再分化再分化器官发生完整植株当前第65页\共有72页\编于星期四\7点②、悬浮细胞培养体系应满足的基本条件悬浮培养物分散性良好，细胞团小（30~50细胞以下）。细胞形状和细胞团大小大致相同，均一性好。细胞生长速度快。当前第66页\共有72页\编于星期四\7点分批培养法：生产周期一般需6天以上。半连续培养法：生产周期近１个月。连续培养法：生产周期可达2~3个月。（２）、

植物细胞悬浮培养方法当前第67页\共有72页\编于星期四\7点

光照有的需要需要植物细胞培养与微生物细胞培养的比较当前第68页\共有72页\编于星期四\7点三、植物细胞培养在食品工业中的应用1983年，日本三井石化公司首先利用紫草细胞培养商业化生产紫草宁。目前，全世界已对近千种植物进行过细胞培养研究，并采用大规模植物细胞培养生产其代谢产物，包括药品、香料、色素、油料、甜味剂、抗氧化剂等，其中许多产物已在医药、食品、化工、农业及林业中得到广泛的应用。当前第69页\共有72页\编于星期