细胞破碎和生化分离技术

细胞破碎和生化分离技术演示文稿当前第1页\共有68页\编于星期四\7点（优选）细胞破碎和生化分离技术当前第2页\共有68页\编于星期四\7点固液分析技术当前第3页\共有68页\编于星期四\7点过滤过滤就是利用多孔性介质截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现固液分离的方法。深层过滤滤饼过滤滤饼阻力主要由菌种和发酵条件决定当前第4页\共有68页\编于星期四\7点改善过滤性能的方法过滤操作的两个目标：加快过滤速率、提高过滤质量。絮凝助滤剂反应剂酶解当前第5页\共有68页\编于星期四\7点过滤设备及选择依据推动力；常压过滤机、加压过滤机、真空过滤机依据设备构造：板框压滤机、鼓式真空过滤机、加压叶滤机当前第6页\共有68页\编于星期四\7点微滤微滤是一种以多孔细小薄膜为过滤介质，以压差为推动力，使不溶物质浓缩过滤的操作。微滤分离过程的三阶段。影响分离速率的因素主要有操作形式、流速、压力和料液浓度。微滤技术有着广泛应用和众多的优点。当前第7页\共有68页\编于星期四\7点微滤的操作模式无流动操作模式和错流过滤操作模式当前第8页\共有68页\编于星期四\7点微滤设备板框式膜过滤器管式膜过滤器中空纤维式膜分离器螺旋卷式膜分离器当前第9页\共有68页\编于星期四\7点离心技术一、离心分离的基本原理二、离心机的类型三、离心方法四、离心条件的确定五、影响离心效果的主要因素与控制当前第10页\共有68页\编于星期四\7点优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；缺点：与过滤设备相比，设备投资高、能耗大、离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同。通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体。而过滤可获得的水分含量较低的滤饼。离心分离当前第11页\共有68页\编于星期四\7点离心的原理对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，可以采用过滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时，发酵液不易被过滤纯化，离心操作往显得十分有效。离心分离：是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。当前第12页\共有68页\编于星期四\7点当前第13页\共有68页\编于星期四\7点差速离心当前第14页\共有68页\编于星期四\7点离心机的类型据分离方式分：沉降式离心机、过滤式离心机据操作方式分：间歇式(分批)离心机、连续式离心机据转速分：常速离心机（低速离心机）、高速离心机、超速离心机据设备结构特点分：管式、蝶式、螺旋式……

当前第15页\共有68页\编于星期四\7点按速度和离心力：1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min)，相对离心力(RCF)104g以下，用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机

1×104～2.5×104rpm，相对离心力104～105g，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机

转速2.5～8×104rpm，相对离心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。离心机的种类与用途当前第16页\共有68页\编于星期四\7点离心方法◆对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果；◆如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。◆而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。当前第17页\共有68页\编于星期四\7点大容量冷冻离心机当前第18页\共有68页\编于星期四\7点据设备结构特点分1斜角式2平抛式3管式4蝶片式5螺旋式6多室式当前第19页\共有68页\编于星期四\7点斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；角度越大，沉降越结实，分离效果越好，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。当前第20页\共有68页\编于星期四\7点当前第21页\共有68页\编于星期四\7点

平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200—800rpm）。颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。样品便于收集受振动和变速搅乱后对流现象小，但转头结构复杂，最高转速相对要低容量也小一些。

当前第22页\共有68页\编于星期四\7点平抛式离心机转子当前第23页\共有68页\编于星期四\7点管式离心机具有一个细长而高速旋转的转鼓，转鼓内装有纵向平板，其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口(对液液分离而言)。分为液液分离的连续式管式离心机和液固分离的间歇式管式离心机。管式离心机当前第24页\共有68页\编于星期四\7点液液分离管式离心机液固分离管式离心机当前第25页\共有68页\编于星期四\7点液固分离管式离心机待处理的物料在一定压力（3×104Pa左右）下由进料管经底部空心轴进入鼓内，靠挡板分布于鼓的四周，并使料液迅速达到与转鼓相同的角速度。转鼓带动物料高速旋转，在离心力下，悬浮液沿转鼓内壁向上流动的，料液在离心力场的作用下因其密度差的存在而分离。澄清后的液相流动到转鼓上部的排液口排出。比重大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成沉渣层，达到一定数量后，停机人工清除。当前第26页\共有68页\编于星期四\7点管式离心机特点：结构简单，可提供较大离心力，转速高，效果好。管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离对于间歇操作式，须定时拆卸、清洗适用于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。当前第27页\共有68页\编于星期四\7点碟片式离心机是在管式离心机的基础上发展起来的，在转鼓中加入了许多重迭的碟片，缩短了颗粒的沉降距离，提高了分离效率。是生物工业中应用最为广泛的一种离心机有一个密封的转鼓，内装十至上百个锥顶角为60-100゜锥形碟片。碟片间的距离一般为0.5-2.5mm。当前第28页\共有68页\编于星期四\7点当前第29页\共有68页\编于星期四\7点碟片式离心机工作原理当悬浮液在动压头的作用下，经中心管流入高速旋转的碟片之间的间隙时，便产生了惯性离心力，其中密度较大的固体颗粒在离心力作用下向上层碟片的下表面运动，而后在离心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向转子外围下滑，而液体则由于密度小，在后续液体的推动下沿着碟片的隙道向转子中心流动，然后沿中心轴上升，从套管中排出，达到分离的目的当前第30页\共有68页\编于星期四\7点碟片式离心机类型人工排渣的碟片离心机碟片上不开孔，只有一个清液排出口。沉积在转鼓内壁上的沉渣，间歇排出。只适用于固体颗粒含量很少的悬浮液。喷嘴排渣的碟片离心机：当固体颗粒含量较多时，可采用具有喷嘴排渣的碟式离心沉降机。在有特殊形状内壁的转鼓壁上开设若干喷嘴活门（活塞）排渣的碟片离心机这是近年来开发的机型，它和相同直径的活塞机相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制剂，疫苗和胰岛素等生产中分离物的澄清。当前第31页\共有68页\编于星期四\7点螺旋卸料沉降离心机有立式和卧式两种卧螺机是一种全速旋转，连续进料，分离和卸料的离心机。最大离心力强度可达6000rpm操作温度可达300℃操作压力一般为常压常用于胰岛素，细胞色素，胰酶等的分离。螺旋式离心机当前第32页\共有68页\编于星期四\7点螺旋式离心机工作原理转鼓与螺旋输送器以一定差速同向高速旋转(后者慢)，悬浮液通过螺旋输送器的空心轴进入机内中部，由进料管连续引入螺旋内筒，加速后进入转鼓。在离心力场作用下，固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积的固相物连续不断定推至转鼓锥端，经排渣口排出机外，较轻的液相物则形成内层液环，由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓，经排液口排出机外。当前第33页\共有68页\编于星期四\7点1、差速离心2、密度梯度离心3、等密梯度离心离心方法当前第34页\共有68页\编于星期四\7点1、差速离心

差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。

※当前第35页\共有68页\编于星期四\7点2、密度梯度离心

（1）定义：密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。

（2）梯度介质：为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5～60%，密度范围1.02～1.30g/cm3。※当前第36页\共有68页\编于星期四\7点（3）不同密度梯度条件下物质的分离离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。当前第37页\共有68页\编于星期四\7点密度梯度离心法当前第38页\共有68页\编于星期四\7点（4）密度梯度的制备：密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。◆密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成，如图。当前第39页\共有68页\编于星期四\7点※密度梯度混合器当前第40页\共有68页\编于星期四\7点（4）所形成密度梯度的类型：制备得到的密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。

※当前第41页\共有68页\编于星期四\7点（5）密度梯度的形成

两种不同浓度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成。※当前第42页\共有68页\编于星期四\7点3、等密度梯度离心

当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。这种方法称为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。

※当前第43页\共有68页\编于星期四\7点五、影响离心效果的主要因素与控制1、样品的理化性质2、离心分离设备3、离心条件的选择（1）离心力和相对离心力（2）离心时间和K因子（3）离心操作温度当前第44页\共有68页\编于星期四\7点细胞破碎技术细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。机械法非机械法珠磨法、压榨法高压匀浆、超声破碎、撞击法固体剪切作用液体剪切作用1）酶溶法2）化学法3）物理法干燥处理溶胞作用超临界细胞破碎当前第45页\共有68页\编于星期四\7点机械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物可采用间歇式或连续操作珠磨机增加装珠量、延长破碎时间、提高转速等手段可提高破碎率→总能耗增加且须注意换热适用于多数微生物细胞，esp.有大量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞当前第46页\共有68页\编于星期四\7点高压匀浆法

破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急剧释放到低压环境破碎作用力：突然减压和高速冲撞阀座阀撞击环操作参数少且易于确定，实验室及工业生产中均可适用于酵母和多数细胞的破碎对易造成堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不适用当前第47页\共有68页\编于星期四\7点超声波破碎机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。缺点：A、影响因素多，细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温；D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。当前第48页\共有68页\编于星期四\7点机械破碎法总结以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验室或工业用）方法珠磨高压匀浆超声破碎使用规模实验室、工业用实验室、工业用实验室适用对象酵母、藻类及丝状真菌酵母菌、细菌细菌当前第49页\共有68页\编于星期四\7点细胞物理破碎方法1）渗透压冲击法（osmoticshock）最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。细胞于高渗介质中，脱水达到平衡后，迅速将其转置于低渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂2）冻结－融化法（FreezingandThawing）细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效当前第50页\共有68页\编于星期四\7点化学法破碎用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来→化学渗透法利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基磺酸钠、TritonX-100；螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、价格昂贵，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需与机械法连用。当前第51页\共有68页\编于星期四\7点生物法破碎原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性溶菌酶lysozyme适用于G＋的细胞壁，若配合EDTA、TritonX-100则可有效作用于G－的胞壁；真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细胞壁结构决定了需要不同的酶当前第52页\共有68页\编于星期四\7点生物法破碎自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，esp.G-的酶溶更受到了限制当前第53页\共有68页\编于星期四\7点超临界细胞破碎技术超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具有较好的流动性能、传质性能和溶解性能利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生破裂可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果当前第54页\共有68页\编于星期四\7点当前第55页\共有68页\编于星期四\7点破碎方法的选择选择的一般原则A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法破碎过程中应注意的问题A、多种破碎方法相结合可产生很大优势B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响D、菌种的培育及改造，胞内产物胞外产物当前第56页\共有68页\编于星期四\7点胞内产物的选择性释放细胞破碎和双水相萃取技术结合利用噬菌体裂解细胞电脉冲提取法分步、分级提取法当前第57页\共有68页\编于星期四\7点双水相分离技术双水相萃取可以同时完成细胞碎片去除和产品纯化任务。双水相萃取技术设备简单、容易放大，但需要较多的原料。当前第58页\共有68页\编于星期四\7点膨胀床吸附技术通过改进吸附剂本身的物理性质和通过对色谱柱进行精心设计，得到了稳定、无返混的流化床，让固体颗粒通过填料层，同时以填充床的模式吸附目标产物。优点：减少操作步骤、提高产品收率、降低纯化费用和资本投入。当前第59页\共有68页\编于星期四\7点层析柱对形成稳定的膨胀床有很大影响，其底部和上部分别有一个液体分布器和床层调节器。选择合适的吸附剂对产物吸附和维持合适膨胀度十分重要，选择时应注意：1、吸附剂应具有良好的吸附性能和流态化性能。2、在粒度和密度上要有差异。当前第60页\共有68页\编于星期四\7点膨胀床的操作五个步骤：当前第61页\共有68页\编于