第二节基因工程的酶学基础演示文稿

第二节基因工程的酶学基础演示文稿当前第1页\共有90页\编于星期三\10点优选第二节基因工程的酶学基础当前第2页\共有90页\编于星期三\10点第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶当前第3页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶

任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制

限制/修饰系统

(R-M,Restriction-modificationsystem)当前第4页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶

人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。维护宿主遗传稳定的保护机制。一、寄主的限制与修饰现象当前第5页\共有90页\编于星期三\10点

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。当前第6页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶当前第7页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

当前第8页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

当前第9页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。

当前第10页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶二、限制性内切酶的类型

限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+

距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸当前第11页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶1.I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

当前第12页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点

在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。

（3）作用机理

需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

Recognizesite

cut

1-1.5kb

当前第13页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶2.II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ

（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

或当前第14页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶（2）切割位点

识别位点处。

切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端当前第15页\共有90页\编于星期三\10点AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用当前第16页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACC

EcoP15:CAGCAG

在基因工程操作中用途不大。当前第17页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+

距识别序列下游24-26bp处随机性切割核酸限制性内切酶的类型及主要特性当前第18页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名

1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：

1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；

流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。

3.

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。

4.

限制酶前面要带上R（Restriction)，

修饰酶前面要带上M（Modification）(现已省略)。当前第19页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名

EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。当前第20页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶四、

Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（一）识别序列识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性

4bp

HpaⅠ

CCGG

HaeⅢ

GGCC

5bp

AvaⅡ

GGWCC

EcoRⅡ

CCWGG

6bp

BamHⅠ

GGATTC

SmaⅠ

CCCGGG

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNNNGGC

12bp

BstXⅠ CCANNNNNNTGC

N=A,T,G,C当前第21页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式

Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。

当前第22页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶1.5’突出的末端当前第23页\共有90页\编于星期三\10点EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’EcoRI37℃5‘…G--C--T--G--OHP--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—POH--G--C--T--C…5’退火4--7℃5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’第一节限制性核酸内切酶当前第24页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶2.3’突出的末端当前第25页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶PstI等产生的3‘粘性末端

5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’PstI37℃5‘…C--T--G--C--A--OHP--G…3’3‘…G--POH--A--C--G--T--C…5’退火4--7℃5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’当前第26页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶粘性末端的意义

①连接便利

i）不同的DNA双链：

只要粘性末端碱基互补就可以连接。

这比连接两个平齐末端容易的多。

当前第27页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶当前第28页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶ii）同一个DNA分子内连接：

通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

当前第29页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶②5’末端标记

凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。

凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③

补平成平齐末端

粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。当前第30页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶3.平头末端当前第31页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶PvuII等产生的平头末端

5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C…5’PvuII37℃5‘…G--C--T--C--A--G--OHP--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--POH--G--A--C--C--T--C…5’当前第32页\共有90页\编于星期三\10点第一节限制性核酸内切酶当前第33页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶四、

Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式

同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。

同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端)。当前第34页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶同尾酶举例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、

BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。当前第35页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

1U

核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时，使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。

大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/L

DTT1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h（DDT：二硫苏糖醇

BSA：牛血清蛋白)0-50mM低盐酶100

mM中盐酶150

mM高盐酶Buffer当前第36页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

在灭菌的1.5ml离心管中进行限制性酶切反应:

20μl体积反应体系如下：

DNA0.2-1μg

10×酶切buffer2.0μl

限制性内切酶

1-2U（单位）

加ddH2O至

20μl

多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。当前第37页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

酶切反应的终止

EDTA（终浓度10mmol/L)或SDS[终浓度0.1%(W/V)]65oC温育

20min

酚/氯仿抽提，乙醇沉淀

酶解结果鉴定

琼脂糖电泳当前第38页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。

局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。

通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。当前第39页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

酶切的注意事项:

1.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。

进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，

再从

-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

2.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

3.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。

当前第40页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（一）酶的纯度

（二）DNA样品的纯度

DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间当前第41页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（三）DNA样品的甲基化程度

采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。

当前第42页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（四）酶切反应的温度与时间

多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃

。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。当前第43页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（五）DNA的分子构型

某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。酶最适温度oC

酶最适温度oC

酶最适温度oC

ApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525当前第44页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（六）限制性核酸内切酶的反应缓冲液

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”（staractivity）现象。

EcoRI*代表EcoRI的星号活力。

星活性的特点:限制酶识别序列特异性降低

例如：EcoRI（高pH值或低盐离子强度）

5’GAATTC3’变成5’NAATTN3’，另有一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。当前第45页\共有90页\编于星期三\10点第一节

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的应用：重组DNA前的切割

构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交

用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针

亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究当前第46页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶剪刀—限制性内切酶针线、胶水—连接酶当前第47页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶DNA连接酶当前第48页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶一、概念与机理

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。当前第49页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶一、概念与机理

DNA连接酶只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！！！！！当前第50页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶DNA连接酶对不同DNA分子的连接作用当前第51页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶二、DNA连接酶的种类（一）T4噬菌体DNA连接酶

特点：

只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

用途：

1)粘性末端的连接

2)平头末端的相连

抑制剂:PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca2+>0.1mM当前第52页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶二、DNA连接酶的种类(二）大肠杆菌DNA连接酶连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子(三）热稳定DNA连接酶以NAD为辅助因子，优先作用于缺口连接酶使用注意事项

1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；

2)只能连接双链DNA分子的单链切口(nick)；

3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的裂口（gap）。DNA连接酶的部分性质连接酶底物辅助因子巯基试剂粘性末端平末端DNA-RNA杂合体RNA-RNA杂合体大肠杆菌DNA连接酶可行可行不行不行NAD+Mg2+不需要T4DNA连接酶可行可行可行可行ATPMg2+

需DTT噬热菌DNA连接酶可行不行不行不行NAD+Mg2+

需要当前第53页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶DNA连接酶应用图解（一）分子间的连接

（二）分子内的连接当前第54页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶三、DNA连接酶的反应体系

10×T4DNALigaseBuffer1μlpMD18-T（30ng/μl）1μl已纯化的PCR产物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnitsddH2O 至10μl当前第55页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶四、影响连接反应的因素

1.插入片段与载体的浓度比例：2-10:1增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象

2.反应温度：一般4~16℃

3.ATP浓度

当前第56页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)1.同聚物加尾法

当前第57页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)2.衔接物连接法

当前第58页\共有90页\编于星期三\10点第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)3.DNA接头（adaptor）连接法

问：衔接物和DNA接头有什么区别？？？衔接物（linker）是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核苷酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。当前第59页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶

3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率

持续能力

大肠杆菌DNA聚合酶

低

有

中

低

Klenowfragment

低

无

中

低

T4DNA聚合酶

高

无

中

低

T7DNA聚合酶

高

无

快

高

化学修饰T7DNA聚合酶

低

无

快

高

遗传修饰T7DNA聚合酶

无

无

快

高

逆转录酶

无

无

低

中

TaqDNA聚合酶

无

有

快

高

DNA聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。当前第60页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。当前第61页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′2.5’→3’外切酶活性3.3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的三种活性当前第62页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I用途：

1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）

2）补齐5’-突起端

3）合成第二条cDNA其中用途2)和3)常用大片段当前第63页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（一）基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。

Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。

当前第64页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（二）用途

1.3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。

2.DNA3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。5’klenow

klenow

5’

当前第65页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（二）用途

3.cDNA第二链的合成

mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow

5’3’3’

5’

5’3’

引物

当前第66页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快）

。

在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

当前第67页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（二）用途当前第68页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶

（一）T7噬菌体DNA聚合酶从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。

（二）T7噬菌体DNA测序酶通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，去除3’5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

当前第69页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、TaqDNA聚合酶

来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。

结构：单亚基MW=94000d。

特点：热稳定性，70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性。用途：

1.PCR反应。

2.测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。当前第70页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶三、逆转录酶（reversetranscriptase）

依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。

来源商品反转录酶有两种：来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(42℃)。来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli(37℃)。

结构和活性：酶类别肽链5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000

++++M-MLV84，000++当前第71页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（reversetranscriptase）

用途：

(1)5’→3’聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子；

(2)RNA酶H活性：对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。

(3)用于３’凹陷末端的标记，杂交探针的制备和DNA序列测定。当前第72页\共有90页\编于星期三\10点第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（reversetranscriptase）

RNaseH活性当前第73页\共有90页\编于星期三\10点第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶来源及特点：

简称末端转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA。用途：

1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。

2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：

生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。

3.用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。当前第74页\共有90页\编于星期三\10点第四节DNA修饰酶当前第75页\共有90页\编于星期三\10点末端转移酶功能图解第四节DNA修饰酶3‘突出末端当前第76页\共有90页\编于星期三\10点一、T4噬菌体多核苷酸激酶来源从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。功能

催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。

不论5’-OH端突出与否。

用途：DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶第四节DNA修饰酶当前第77页\共有90页\编于星期三\10点二、碱性磷酸酶

1）碱性磷酸酶种类

细菌性碱性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase，BAP），从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。

小牛肠碱性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase，CIAP），从小牛肠中纯化出来。加热68℃可完全失活。

2）碱性磷酸酶的特性

催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

3’HO-

-P

5’

3’HO-

-OH

5’3’HO-

-OH

碱性