原生质体的培养与融合

原生质体的分离与纯化原生质体培养原生质体融合本章主要内容当前第1页\共有45页\编于星期三\21点原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。当前第2页\共有45页\编于星期三\21点微丝叶绿体线粒体质膜细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图液泡当前第3页\共有45页\编于星期三\21点第一节

原生质体分离及纯化一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞当前第4页\共有45页\编于星期三\21点多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。（一）材料来源禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。当前第5页\共有45页\编于星期三\21点（二）分离方法机械分离法酶法分离法当前第6页\共有45页\编于星期三\21点1、机械分离法（Machanicalisolation）优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）局限性大当前第7页\共有45页\编于星期三\21点（1）酶的种类纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶2、酶法分离（Enzymaticisolation）当前第8页\共有45页\编于星期三\21点当前第9页\共有45页\编于星期三\21点（2）酶液的配制渗透压稳定剂及pH酶的配比及浓度果胶酶：浓度不宜超过2%,纤维素酶(1-2%)渗透压稳定剂:（500－600mmol/L甘露醇)当前第10页\共有45页\编于星期三\21点（3）分离原生质体两步分离法一步分离法方法有二：叶肉原生质体分离提纯当前第11页\共有45页\编于星期三\21点图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶当前第12页\共有45页\编于星期三\21点叶片愈伤组织当前第13页\共有45页\编于星期三\21点二、原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法当前第14页\共有45页\编于星期三\21点1、离心沉淀法原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。当前第15页\共有45页\编于星期三\21点2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：滤液和高渗溶液混合，离心。第三步：小心吸取上层原生质体，洗涤液重复洗2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。当前第16页\共有45页\编于星期三\21点

3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。当前第17页\共有45页\编于星期三\21点（二）原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别1）0.1%酚番红染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）0.025%Evans蓝染色：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取

2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。当前第18页\共有45页\编于星期三\21点第二节原生质体培养一、培养基pH渗透压钙源生长物质氮源碳源培养基当前第19页\共有45页\编于星期三\21点二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法当前第20页\共有45页\编于星期三\21点肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株植株再生途径当前第21页\共有45页\编于星期三\21点定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第三节原生质体融合当前第22页\共有45页\编于星期三\21点原生质体融合当前第23页\共有45页\编于星期三\21点一、原生质体融合意义—克服杂交不亲合—克服生殖器官败育—克服多胚现象当前第24页\共有45页\编于星期三\21点当前第25页\共有45页\编于星期三\21点番茄+马铃薯当前第26页\共有45页\编于星期三\21点二、融合方法无机盐诱导融合高pH-高Ca离子聚乙二醇(PEG)法

PEG结合高钙-高pH诱导法电融合技术当前第27页\共有45页\编于星期三\21点(一)无机盐诱导融合:NaNO3法1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。当前第28页\共有45页\编于星期三\21点

1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca离子法当前第29页\共有45页\编于星期三\21点PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母PolyethyleneGlycol（聚乙二醇）（三）PEG法当前第30页\共有45页\编于星期三\21点PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。当前第31页\共有45页\编于星期三\21点PEG法示意图-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触当前第32页\共有45页\编于星期三\21点最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞（四）PEG结合高钙-高pH诱导法当前第33页\共有45页\编于星期三\21点(五)电融合技术Senda首先用此方法实现原生质体融合细胞融合仪当前第34页\共有45页\编于星期三\21点电融合法原理交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极正极+-+-+-+-+-+-+-+-当前第35页\共有45页\编于星期三\21点施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-当前第36页\共有45页\编于星期三\21点原生质体的融合过程：当前第37页\共有45页\编于星期三\21点三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法2、机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法当前第38页\共有45页\编于星期三\21点当前第39页\共有45页\编于星期三\21点异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3.双荧光标记选择法当前第40页\共有45页\编于星期三\21点当前第41页\共有45页\编于星期三\21点四、体细胞杂种植株的鉴定形态学鉴定细胞学观察

DNA多态性分析同