多聚酶链式反应扩增片段新

多聚酶链式反应扩增片段新第一页，共三十九页，编辑于2023年，星期五DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就由可能为案件的侦破提供证据。讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？第二页，共三十九页，编辑于2023年，星期五★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖

第三页，共三十九页，编辑于2023年，星期五（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:一、基础知识脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第四页，共三十九页，编辑于2023年，星期五脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCTDNA的基本单位－脱氧核苷酸12345O第五页，共三十九页，编辑于2023年，星期五鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸的种类A腺嘌呤脱氧核苷酸GCT第六页，共三十九页，编辑于2023年，星期五一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图第七页，共三十九页，编辑于2023年，星期五ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端DNA分子的平面结构第八页，共三十九页，编辑于2023年，星期五DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端

识别：-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。第九页，共三十九页，编辑于2023年，星期五4.DNA分子的双螺旋结构⑴.DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。⑵.

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。⑶.两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与

配对，

一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤第十页，共三十九页，编辑于2023年，星期五（1）DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。4.DNA双螺旋结构特点：（2）

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（A）一定与

配对，鸟嘌呤（G）一定同

配对。两条反向平行双螺旋脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）第十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期五2、时间：细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）1、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）二．细胞内DNA复制的过程第十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期五4、条件：①模板：亲代DNA的两条母链②原料：游离的四种脱氧核苷酸③能量：ATP④

酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对5、过程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代DNA第十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期五6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸第十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期五第十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期五8.遵循原则：碱基互补配对原则9.精确复制的原因a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行10.复制的意义:DNA分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。第十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期五参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：细胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸,通常是一小段RNA第十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期五解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链的原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸

思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？

变性（80～100℃

）TaqDNA聚合酶（耐高温）20～30个核苷酸构成DNA或RNA第十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期五条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子链能量ATP不需要引物一般是一小段DNA或RNA,20-30个核苷酸使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（一）、PCR的技术（DNA体外复制）的条件二、PCR（多聚酶链式反应）第十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期五（二）PCR原理DNA双链变性（加热80-100℃

）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物1和引物2与两条单链的结合第二十页，共三十九页，编辑于2023年，星期五PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。第二十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期五1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1～3步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸变性→复性（退火）

→

延伸（三）PCR的反应过程：第二十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期五PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：

四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。第二十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期五二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/第二十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期五5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。第二十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期五每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结第二十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期五三、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器

用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器第二十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期五第二十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期五4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。第二十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期五（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步骤：第三十页，共三十九页，编辑于2023年，星期五四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算50倍蒸馏水做对照波长260nm处读数第三十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期五（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、

a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理

可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关第三十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期五光吸收波长／nm2602402202800.10.2第三十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期五2、过程①稀释2µL

PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定并计算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数第三十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期五50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA

的含量为50g/mL紫外分光光度计比色杯第三十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期五体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸第三十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期五课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算第三十七页，共三十九页，编辑于2