浅论RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响

浅论RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响【摘要】目的：探讨中期因子(midkine，MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响。方法：培养人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株，以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者。采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株，分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平，然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性，以Boyden方法检测癌细胞侵袭力。结果：4株胃癌细胞中，中期因子均有不同程度的表达，以胃癌BGC823细胞最高;以MKsiRNA转染胃癌BGC823细胞后，癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降，且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降，细胞侵袭力明显下降。结论：中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞，可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力。

【关键词】胃癌;中期因子;RNA干扰;黏附;侵袭

[Abstract]Objective:Tostudytheeffectsofmidkine(MK)genesmallinterferingRNA(siRNA)onadhesionandinvasionofhumangastriccancercell.Methods:RealtimePCRwasusedtoevaluatetheMKmRNAexpressionofhumangastriccancercelllinesBGC823,HGC27,MGC803andSGCcellofMKhighestexpressionwastransfectedwithdifferentdoseofMKsiRNA.TheexpressionofMKmRNAandproteinwereweredeterminedbyrealtimequantitativePCRandimmumoflurescencecelladhesionwasevaluatedbyMTTassay,andinvasionwasexminedbyBoydenchamber,respectively.Results:CelllineBGC823showedthehighestelevationofMKmRNAinfourgastriccancercelllines.TheresultsfromrealtimequantitativePCRandimmumoflurescencemethodshowedthatMKmRNAandproteinreducedintimeanddosedependentmanners(;).Theadhesive,andinvasiveabilityofBGC823celltreatedwithMKsiRNAdecreasedcomparedwithcontrolgroups(,).Conclusion:MKgenemightplayanimportantroleinadhesionandinvasionofhumangastriccancercell.siRNAtargetedMKcouldeffectivelyinhibitadhesion,migration,andinvasionofhumangastriccancercell.

[Keywords]gastriccarcinoma;midkine;RNAinterference;adhesion;invasion

尽管胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步，但进展期胃癌的预后依然很差，5年生存率徘徊在20%～30%。己经证实，胃癌的发生发展是多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥了重要作用，如细胞黏附、信号传导、细胞分化、细胞增殖及转移。更好地了解胃癌发生发展的分子机制将有利于胃癌的诊治及预防。

许多研究表明生长因子不仅促进组织细胞的增殖，而且能诱导组织细胞的恶性转化，在肿瘤的发展中发挥了重要的角色。中期因子(midkine，MK)基因是1988年Muramatsu等[1]在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现的一种新基因，其后，在多种动物和人类中均已发现了中期因子基因。中期因子和另一种相似的细胞因子——多效生长因子(pleiotrophin，PTN)一起归为一类新的肝素结合因子家族(heparinbindingfactorfamily)[1]。研究发现，中期因子在许多肿瘤如食管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、肺癌等多种癌细胞和组织中过表达，而在正常组织中表达很低或不表达[2-7]。因此，中期因子有可能作为肿瘤标志物在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥作用。目前，关于中期因子与胃癌的关系研究较少。

本研究以胃癌细胞为模型，以小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)介导的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术下调癌细胞中期因子表达，旨在探讨中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中的可能作用。

1材料和方法

材料

人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株，由本院组织细胞生物库冻存。MKsiRNA正义链序列：5′AGGACUAGACGCCAAGCCUTT3′，由美国Dharmacon公司合成。RPMI1640购自Gibco公司;Trizol、实时PCR扩增试剂盒和脂质体转染试剂LipofectamineTM2000及逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;鼠抗人MK及β肌动蛋白抗体购自SantaCruz公司;MTT购自Sigma公司;基膜基质Matrigel购自BectonDickinson公司。

方法

细胞培养

胃癌细胞在含10%胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的RBMI1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。待对数生长期时，收取细胞，进行以下试验。

胃癌细胞MKmRNA检测

采用荧光实时定量RTPCR方法检测中期因子mRNA。

细胞总RNA提取及cDNA合成

根据说明书，分别采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。

定量RT

PCR采用荧光实时定量PCR检测。收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA,取总RNA1μg，以OligodT(15mer)为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2μl为模板进行PCR扩增，步骤参照逆转录试剂盒说明书进行。引物序列上游：5′GCGCGCTACAATGCTCAGT3′，下游：5′CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT3′。FAM探针：5′CATGGGTGCCCCGACGTTGC3′TAMRA。PCR反应条件：95℃，预变性3min，95℃30s，52℃45s，72℃45s;35个循环后，72℃再延伸7min。反应后生成熔解曲线。MK基因表达值以2-ΔΔCt表示。

siRNA转染

借助于LipofectamineTM2000进行转染，具体操作参照说明书进行。转染前1d，将×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1ml/孔，培养过夜。次日进行转染。细胞分组：①空白对照组(ConA)：未经任何处理的胃癌细胞;②空载对照组(ConB)：即脂质体对照组;③错配对照组(ConC);④siRNA组：10%FBS的RPMI1640中含不同浓度的已用脂质体包埋的siRNA。

转染后中期因子基因mRNA及蛋白水平检测

mRNA水平

采用荧光实时定量RT-PCR方法检测，方法同上。

蛋白水平

采用免疫荧光法检测。将胃癌细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，细胞和盖玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加MK单克隆抗体(1∶1000)覆盖整个切片，4℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗，37℃保温30min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察，拍照，荧光强度扫描。

胃癌细胞黏附力检测

参照文献方法进行，部分步骤有改动。96孔培养板的每个孔铺以50μl基质胶(1∶20稀释)，然后每孔加入含10mg/ml小牛血清白蛋白的无血清RPMI1640培养液50μl，作用1h。每孔加入2×104的悬浮细胞，放入CO2培养箱中。作用1h后，没有黏附到培养板上的细胞被洗掉，已经黏附的细胞被胰酶消化，然后计细胞数。黏附力=siRNA组细胞黏附数/ConA细胞黏附数×100%。

采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭能力

Boyden小室上下室之间铺聚碳酸醋微孔滤膜(孔径8μm)，滤膜上包被有Matrigel。用无血清培养基准备单细胞悬液，并调整浓度为×104/ml。细胞以500μl无血清培养基重悬，接种于培养小室的上层，小室下层加入500μl含10%FBS的培养基作为趋化物。在37℃，5%CO2，饱和湿度条件下分别培养72h后，用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未侵袭细胞;接着固定30min，PBS漂洗2次;HE染色30min。随机选择5个100倍显微视野统计总细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。每组设3个平行样本，取其平均值，进行统计学分析。

统计学分析

数据资料以x±s表示，以SPSS统计软件分析。用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐，用单因素方差分析，组间及组内比较用LSDt检验;若方差不齐，用GamesHowell法进行分析。

2结果

胃癌细胞株中期因子基因mRNA表达水平

荧光定量PCR结果显示熔解曲线具有单峰特异性。见图1。荧光实时定量RTPCR结果显示，MKmRNA在MGC803、SGC7901、HGC27及BGC823分别为±、±、±、±。BGC823细胞株中MKmRNA水平最高。故后续试验以BGC823细胞为模型。图1中期因子基因熔解曲线

siRNA转染对胃癌BGC

823细胞MK基因mRNA和蛋白水平的影响定量PCR和免疫荧光结果显示，siRNA转染组细胞中期因子mRNA以及蛋白水平明显下降，且呈浓度和时间依赖性(，)。见图2，图3。图2siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子基因mRNA的影响图3siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子水平的影响

中期因子基因siRNA转染对胃癌细胞黏附力的影响

结果显示，与ConA对照组比较，MKsiRNA转染组细胞黏附明显受到抑制，且呈浓度依赖性()，而脂质体对照组(ConB)无明显变化。见图4。图4中期因子基因siRNA转染对胃癌BGC823细胞黏附力的影响

siRNA转染对BGC823细胞侵袭能力的影响

Boyden小室上室细胞穿过膜上Matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。Boyden小室结果显示，与对照组比较，MKsiRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且呈浓度依赖性()。见图5。图5中期因子siRNA转染对胃癌细胞侵袭力的影响

3讨论

中期因子是肝素结合生长因子家族的成员。人中期因子基因定位于，由5个外显子和4个内含子组成。其启动子区域有视黄酸反应元件，因此视黄酸可诱导胚胎瘤细胞系和某些组织中期因子的表达。成熟的中期因子是一种分泌性蛋白，在妊娠中期胎儿组织中分布广泛，出生后表达水平降低。在正常成人组织中，中期因子在小肠黏膜高表达，在甲状腺中度表达，在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达，而在肝脏完全不表达。

近年来研究发现，中期因子高表达于多种人类恶性肿瘤，如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、神经母细胞瘤和Wilm′s瘤等。本研究采用荧光实时定量PCR方法检测4株胃癌细胞中期因子基因表达，发现BGC823细胞中期因子表达最高。进一步以BGC823细胞为模型，采用中期因子基因siRNA转染该细胞后，分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法检测，结果显示，转染组胃癌细胞MKmRNA和蛋白水平明显下调，且呈时间和浓度依赖性。

癌的侵袭与转移是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。其中细胞黏附和侵袭是关键步骤。本实验通过RNA干扰技术下调胃癌BGC823细胞中中期因子基因表达，并观察癌细胞黏附和侵袭力的变化。结果显示，中期因子基因表达下调后，癌细胞黏附和侵袭力明显下调，且呈浓度依赖性。

本研究结果提示，中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中发挥着重要的作用，以该基因为靶点开展胃癌的靶向治疗，将会有助于胃癌的综合治疗。

【参考文献】

[1]KadomatsuK,TomomuraM,MuramatsuT.cDNAcloningandsequencingofanewgeneintenselyexpressedinearlydifferentiationstagesofembryonalcarcinomacellsandinmidgestationperiodofmouseembryogenesis[J].BiochemBiophysResCommun,1988,151(3):1312-1318.

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IbusukiM,FujimoriH,YamamotoY,et