心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特性

心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特性【摘要】目的：研究急性分离小鼠心肌细胞肿胀激活氯离子通道的单通道特征.方法：采用膜片钳单通道方法，记录急性分离的小鼠心肌细胞暴露于低渗溶液时出现的肿胀激活氯通道电流().结果：等渗状态下，用细胞贴附式记录，多数心肌细胞膜片无通道活动，用低渗溶液灌流细胞，在细胞容积增大的同时，出现单通道电流的激活.该肿胀激活单通道氯电压在-100mV~+100mV均有激活.在电压+100mV时，其单通道电导为(±)pS，开放概率为±，电流电压曲线显示其反转电位(-±)mV,接近氯离子平衡电位的理论值(ECl=-mV),且反转电位随氯离子浓度的改变而改变.氯通道阻断剂DIDS可逆性阻断该单通道电流.结论：小鼠心肌细胞肿胀激活氯通道的单通道电导为(±)pS，电流呈外向整流特征并对DIDS敏感.

【关键词】心肌/细胞学；肿胀激活氯离子通道；膜片钳术

0引言

调节性细胞容积减小指的是细胞暴露于低渗透压环境时，细胞膨胀、容积增大激活了细胞的容积调节功能，导致胞内的溶质及水份外流，使已膨胀的细胞容积向正常容积转化的过程.在心肌细胞，RVD功能的异常是缺血再灌注损伤、心力衰竭、心肌肥厚等多种心脏疾病过程中细胞凋亡与坏死以及心律失常发生的关键.因此，阐明心肌细胞RVD过程的机制，了解参与心肌细胞容积调节的离子通道特性和分子定位，具有重要的生理学与病理生理学意义.关于小鼠心肌细胞上肿胀激活的氯通道的单通道特性目前尚无报道.我们在急性分离的小鼠心肌细胞上，应用膜片钳细胞贴附式和内面向外式方法观察了低渗溶液激活的氯通道的单通道特性.

1材料和方法

材料

5~7周龄的成年雌性C157小鼠.实验中所用药品和试剂除EGTA购自日本Wako公司外，Hepes,Nifidipine,TEACl,4,4diisothiocyanostilbene2,2disulfonicacid和tetrodotoxin等均购自Sigma公司.

方法

单个小鼠心肌细胞的分离实验用小鼠，ip注射肝素抗凝，20min后，10g/L戊巴比妥钠麻醉.打开胸腔，迅速取出心脏，放在冰分离液中，主动脉插管Langendorff装置进行灌流.用灌流液冲洗心脏3~5min后，改用含有g/L胶原酶和1g/LBSA的灌流液灌注8~15min，最后用冰灌流液冲洗残酶约7min.将心脏剪碎,分离单个心肌细胞置于保存液，吹打过滤后，4℃保存待用.灌流过程中，液体温度保持37℃，所有液体用纯氧饱和.灌流液(mmol/L)：NaCl,KCl4,NaH2PO4,MgSO4,Hepes10,葡萄糖11(用NaOH调pH至).

电生理学实验取分离好的单个心肌细胞置于灌流槽中，灌流无钙台氏液.待细胞稳定贴壁后，灌流等渗细胞外液，形成巨阻封接，室温下采用膜片钳单通道细胞贴附式和内面向外式方法［1］记录肿胀激活单通道氯电流.电极采用硼硅酸玻璃管经电极拉制器(P2000:SutterInstruments,Novato,CA)多步拉制而成.冲灌电极液后电阻为5~6MΩ.电流经EPC9放大器(HEKAElectroniks,Lambrecht,德国)放大后，电流信号采样频率为10kHz，经滤波后，记录到Pulse和Pulsefit软件系统中(HEKAElectroniks,Lambrecht,德国).数据分析应用PulseMate和Origin(OriginLabInc.,Northampton,MA)软件.

电生理学实验所用液体：电极内液:NMDGCl85,NaCl10,4AP2,BaCl2,NaH2PO4,MgCl24,Hepes10,glucose,TEACl5,TTX8μmol/L,nifidipine5μmol/L,,加入甘露醇调节溶液的渗透压为305Osmmol/kg.低渗灌流液:NMDGCl113,MgATP5,NaGTP,EGTA5,Hepes5,渗透压为230Osmmol/kg.在研究氯离子通道选择性的实验中，灌流液中等量的Cl-由天冬氨酸代替.为验证肿胀激活单通道氯电流对氯通道阻断剂DIDS的敏感性，用含有500mol/LDIDS的低渗灌流液灌流细胞，观察其对单通道开放概率的抑制作用.等渗灌流液是在低渗溶液中加入甘露醇调节渗透压到305Osmmol/kg.实验过程中灌流液中持续加入8μmol/LTTX，5μmol/Lnifidipine以阻断电压依赖性Na+通道和LtypeCa2+通道.所有溶液的渗透压应用冰点渗透压测量仪(OM802,Vogel,德国)测量.阻断剂DIDS用二甲基亚砜配置50mmol/L的储存液保存，使用时稀释到500μmol/L灌流细胞.

统计学处理：采用统计学软件包完成，所有数据以x±s表示.用阻断剂前后的比较采用配对t检验，即认为有统计学差异.

2结果

小鼠心肌细胞肿胀激活单通道氯电流的电压依赖性在等渗状态下，多数小鼠心肌细胞膜片无通道活动.低渗溶液(230Osmmol/kg)灌流细胞，15～30min后，细胞容积增大，同时，有些在等渗条件下无通道活动的膜片出现单通道电流的激活，通道激活的时间一般是在低渗溶液灌流后的(13±4)min.一旦单通道电流出现，就将该膜片游离形成内面向外式记录方式.Fig1A所示的即为在等渗时无电流活动，用低渗溶液灌流后出现通道活动的一个膜片记录结果.可见，在细胞内外氯离子浓度对称时，在电压-100mV~+100mV范围内，均有通道开放，且能稳定20min以上，在+100mV和-100mV钳制电压时，电流的幅度分别为(±)pA和pA,(n=11)，表现出明显的外向整流特征.Fig1B为单通道电流的电流/电压曲线.当低渗灌流液中氯离子的浓度由113mmol/L改为25mmol/L时，电流的反转电位向更负的方向偏移，由0mV偏移到了对电流的开放产生明显抑制作用，约3min达到最大作用，此时单通道开放时间明显缩短，而关闭时间延长(Fig3).在+100mV，通道的开放概率由±降低为±.DIDS的阻断作用是可逆的，冲洗后阻断作用消失.

3讨论

Nilius等［2］首先在内皮细胞记录到了低渗激活的氯通道电流，发现该电流可明显减轻细胞在低渗状态下水肿的程度.到目前为止，肿胀激活氯通道已被证实广泛分布在多种哺乳动物的细胞膜上［3］.在犬和兔的心房肌细胞和窦房结细胞［4-6］、豚鼠心室肌细胞，培养的鸡心肌细胞［7,8］和人心房肌细胞［9,10］上均证实了的表达，且的全细胞电流具有共同的电生理学特点:对氯离子的高度选择性;外向整流特性;在去极化电压下的时间依赖性失活等.而关于该通道的单通道特性报道较少.尤其在小鼠心肌细胞未见报道.我们应用膜片钳单通道记录方法，探讨了小鼠心肌细胞肿胀激活氯电流的单通道特性，证实该通道能够被低渗溶液激活，单通道电导约为38pS，可逆性被DIDS阻断，这与Duan等［11］报道的兔心房肌细胞容积敏感性氯通道的单通道特性相似.但小鼠心肌细胞肿胀激活氯通道对DIDS敏感性低于兔心房肌细胞，其机制有待进一步探讨.

研究心肌细胞的，不仅有助于明确生理状态下细胞的容积调节机制，而且很有可能成为临床治疗的新的切入点.因为它不仅参与细胞的容积调节，而且与心肌缺血/再灌注损伤的保护作用和细胞凋亡有关.在心肌缺血时，由于局部代谢障碍，心肌细胞肿胀，此时激活，在一定程度上有利于保护心肌细胞，避免细胞由于过度肿胀而导致心肌细胞坏死.

【参考文献】

［1］HamilOP,MartyAJ,NeherE,etal.Improvedpatchclamptechniquesforhighresolutioncurrentrecordingfromcellsandcellfreemembranepatches［J］.PflugersArch,1992;422:143-150.

［2］NiliusB,EggermontJ,VoetsT,etal.Propertiesofvolumeregulatedanionchannelsinmammaliancells［J］.ProgBiophysMolBiol,1997;68:69-119.

［3］TsengGN.Cellswellingincreasemembraneconductanceofcaninecardiaccells:Evidenceforavolumesensitiveanionchannels［J］.AmJPhysiol,1992;262:C1056-C1068.

［4］SorotaS.Swellinginducedchloridesensitivecurrentincanineatrialcellsrevealedbywholecellpatchclampmethod［J］.CircRes,1992;70:679-687.

［5］OkadaY.Volumeexpansionsensingoutwardrectifier,Cl-channel:Freshstarttothemolecularidentityandvolumesensor［J］.AmJPhysiol,1997;273:C755-C789.

［6］HagiwaraN,MasudaG,IrisawaH.Stretchactivatedanioncurrentsofrabbitcardiacmyocytes［J］.JPhysiol,1992;456:285-302.

［7］VandenbergJ,YoshidaA,KirkK,etal.Swellingactivatedandisoprenalineactivatedchloridecurrentsinguineapigcardiacmyocyteshavedistinctelectrophysiologyandpharmacology［J］.JGenPhysiol,1994;104:997-1017.

［8］,FerminiB,NattelS.AlphaadrenergiccontrolofvolumeregulatedCl-currentsinrabbitatrialmocytes［J］.CircRes,1995;77:379-393.

［9］OzMC,SorotaS.Forskolinstimulatesswellinginducedchloridecurrent,notcardiaccysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorcurrent,inhumancardiacmyocytes［J］.CircRes,1995;76:1063-1070.