中国科学技术大学-遗传学实验

PAGEPAGE10…………….遗传学实验张文锐黄丽华高永翔中国科学技术大学生命科学学院实验教学中心目录实验一有丝分裂（Feulgen）制片技术3实验二减数分裂制片技术7附：临时制片与永久制片技术实验三果蝇的形态、生活周期及饲养11实验四果蝇的伴性遗传16实验五果蝇的唾腺染色体制片技术20实验一有丝分裂（Feulgen染色）制片技术一、实验目的1基本技术；2动态变化；3、掌握Feulgen染色方法。二、基本原理有丝分裂（mitosis）是植物细胞分裂的主要方式，细胞分裂过程中，核内Feulgen是鉴别细胞中DNADNA(通常位于核及染色体上)在1NHCl60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合。当用这种无色的亚DNA游离的醛基结合，从而使DNA。这一反应是1924FeulgenDNA三、材料和器材1、实验材料：（Viciafaba,2n=12（或其它植物（Alliumcepa,2n=16）根尖。2、实验仪器及用具：水浴锅(60℃水浴)、显微镜、培养箱、电子天平、酒精灯、100℃温度计、具塞试管、吸管、滤纸条等。3、药品和试剂：卡诺氏固定液（冰醋酸:无水酒精=1:3、秋水仙碱（或8－羟基喹啉、无水乙醇、1NHCl、45醋酸、0.2秋水仙素、碱性品红、偏重亚硫酸钠（钾Schiff试剂的配制Schiff1g碱性品红200ml550-55℃25℃20ml1NHCl1-3g(KSO225亚硫酸钠(NaSO)。摇动使溶解，密闭瓶口置黑暗低温处或冰箱内 (4℃左223右)18-24h0.5-1g110-5℃5-6偏重亚硫酸钾(KSO(NaSO1NHClSO、SO225 223 2 2与碱性品红反应生成碱性品红——亚硫酸溶液，呈无色。漂染液的配制取10%亚硫酸钠10ml，加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCl即可。四、实验方法和步骤1、材料准备、蚕豆根尖：选取新鲜无病斑的蚕豆干种子，经日晒后，放在烧杯内，室20℃左右保湿培养（双层纱布覆盖，1－2cm9:00－10:3014:00－16:00、洋葱根尖：通过休眠的洋葱鳞茎，经日晒后，置于盛有清水的小烧杯上20－25℃2－31－2cm9:00－11:002、预处理为获得较多中期分裂相的细胞，且使染色体缩短和分散，可对根尖进行预处理，方法如下（取其一即可：1、0.05％－0.2％的秋水仙碱水2－42、0.002M8－3－4(31－4℃243、固定（冰醋酸:无水酒精=1:3（15）30－6090％→80％酒精→70％（各半小时）浸泡进行转换，最后置于70％0－4℃冰箱，约可保存半年。如保存时间太长，需重新固定后再用。4、Feulgen染色法(1)、取经预处理并固定好的洋葱根尖，用水洗2-3分钟，放入室温条件下的1NHcl处理根尖材料2-3分钟。60HCl600.5℃的条件下8-10HCl，1NHCl1-2，然后2-3。Schiff30、漂染液冲洗三次510-15、取根尖（紫红色部分）45醋酸，（HCl5、显微观察：制备好的细胞学片子，置于显微镜上，先用低倍镜相的细胞，再转换到高倍镜（10×40）下观察。6、影响孚尔根（Feulgen）反应的主要因素水解时间和温度主要关键不足浅淡细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色过度着色不匀DNA游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中普遍着色使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA定量一般只能用不含金属离子和甲醛酒精-醋酸固定液等。(3)SO2

含量：Schiff试剂中的SO2

含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。(4)DNADNADNA有大、中型染色体适于用孚尔根反应五、实验报告1、绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期。2、直接固定和经过预处理后固定的材料，其分裂相有何不同？3、经温HCl处理和不经处理的制片有何区别，为什么？实验二减数分裂制片技术一、实验目的1、了解植物生殖细胞的形成过程；2、熟悉减数分裂各时期的特点，加深对减数分裂的认识；3、掌握植物花粉母细胞的压片技术和方法。二、基本原理减数分裂（meiosis）,又称成熟分裂（maturationdivision）是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊方式的有丝分裂。性母细胞（连续进行两次核分裂（第一次分裂和第二次分裂，形成四个染色体数目减半的(n)（n（2n。确保了亲代与子代间染色体数目的恒定性，从而保证了物种相对的遗传稳定性。在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜下观察到植物细胞的减数分裂。整个减数分裂可分为下列各个时期：第一次分裂前期Ⅰ减数分裂的特点之一就是前期Ⅰ特别长，而且又较复杂。通常根据细胞核内结构变化特征又将这一期分成五个时期，即双线期和终变期。（leptotene细而长的丝状体已经复制为二个染色单体，但在显微镜下还看不出结构上的双重性。偶线期(zygotene)pairingn偶线期。粗线期pachytene二价体逐渐缩短变粗四合体(tetrad)非姊妹染色单体间出现交换（crossingover）,造成遗传物质的重组。双线期(diplotene)：配对的同源染色体进一步缩短变粗，由于同源染色体间发生过互换，开始分离而出现交叉（chiasmata）现象。此时染色体呈现扭花状。终变期(diakinesis)（terminalizatio显著收缩均匀地分散XOV膜、核仁才开始消失。此时有利于染色体计数。前期Ⅰ都具有较明显的核仁显著标志，进入中期,核膜、核仁才开始消失。体开始分离。此时也是鉴定染色体数目和形态的最好时期。后期Ⅰn染色体，每一染色体含有两个染色单体。实现了染色体数减半（2n→n。末期Ⅰ新形成，胞质分裂，成为两个子细胞，称为二分体（dyad。中间期（interkinesis）在第二次分裂开始之前，两个子细胞进入间期。但有的植物和大多数动物不经过间期，直接进入第二次分裂。间期的时间短，无DNA复制，故DNA含量没有变化。第二次分裂前期Ⅱ染色体缩短变粗，开始清晰起来。每个染色体含有一个着丝粒和纵向排列的两条染色单体。前期快结束，染色体变得短粗、清晰可见，核膜消失。中期Ⅱ染色体排列在赤道面上，两条染色单体开始分裂。此时细胞的染色体数为n，每一染色体有两条染色单体。后期Ⅱ着丝点分裂为二，两条染色单体由纺锤丝分别拉向两极，每极含有n条染色体。末期Ⅱ染色体逐渐解旋，核膜重建，核仁重新形成，同时细胞质又分为两部分，各成为两个子细胞。（tetrad）或四分孢子(tetraspore)。各细胞的核里的染色体只有最初细胞染色体的一半，2nn。三、材料和器材1、实验材料：玉米雄花序（2n=20）2、实验仪器及用具：显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片等。3、药品和试剂：Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶145%醋酸等。四、实验方法和步骤1、采集玉米不同花期的雄花序用新配制的Carnoy固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）18—2480%70%70%2—32、取经过固定的雄花序，选取长0.5cm左右的小花，用解剖针或镊子挑出花药（3，置于载玻片上。3在花药上滴一滴醋酸洋红截成几段花药中的花粉母细胞。4、去除花药残渣，适当涂匀玻片，盖上盖玻片，垫一张滤纸，以大拇指均匀按压，注意，不要滑动盖玻片！吸去多余染液即可镜检。若高倍镜观察颜色太深，可在酒精灯火焰上过几遍，微烫，使细胞质透明，增大反差，注意不要拷过度！5、显微镜下观察，寻找减数分裂各期图象，熟悉各时期特点。五、实验报告绘制观察到的典型的减数分裂各期分裂相。为什么说减数分裂是经典遗传学的根本？简述减数分裂各个时期染色体的特征。附：临时制片与永久制片置低温下一般可保存数星期。Ⅱ、永久制片：1、将制好的片子有盖玻片的一面向下浸入95%1：冰醋酸11-2295%2：11-23，移入95%酒精1：正丁醇2的混合液中1-2分钟。4，1-2（至少两次。5，加拿大树胶（或中性树胶）封存。实验三果蝇的形态、生活周期及饲养一、实验目的1、了解果蝇生活史中各个不同阶段的形态特点；2、区别雌雄果蝇以及几种常见突变类型的主要性状特征；3、掌握实验果蝇的饲养、管理及实验处理方法和技术。二、基本原理1、果蝇的生活史果蝇属于昆虫纲，双翅目，果蝇属，与家蝇是不同的种。30℃果蝇培养的最适温度为20-25℃。10℃10℃15℃20℃25℃卵幼虫幼虫成虫8557186.34.210251512两天后才能产卵为椭圆形，腹面稍扁平，在背面的前断伸出一对触丝，它能使卵附着在食物(或瓶壁)上，不致深陷到食物中去。幼虫：从卵孵化出来后，经过两次蜕皮，发育成三龄幼虫，此时体长可达4-5mm。肉眼可见其前端稍尖部分为头部，上有一黑色斑点即为口器。口器后面，而卵巢则较小，可以此作为鉴别。幼虫活动生长良好。7-8渐形成一梭形的蛹.在蛹前部有两个呼吸孔，后部有尾芽，起初蛹壳颜色淡黄而柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，表明即将羽化了。粗圆形，双翅展开。体色加深。如野生型初为浅灰色，然后呈灰褐色。2、形态构造头部有一对复眼，三个单眼和一对触角；胸部有三对足，一对翅和一对平衡棒；腹部背面有黑色环纹，腹面有腹片，外生殖器在腹部末端，全身有许多体毛和刚毛。雄果蝇 雌果蝇3、成虫雌雄的鉴别性状雌果蝇雄果蝇体型较大较小第一对足跗节无性梳有性梳腹末端钝而圆稍尖腹片6个4个腹背面条纹5条3条外生殖器简单复杂突变形状名称基因符号形状特征突变形状名称基因符号形状特征所在染色体白眼w复眼白色X棒眼B复眼横条形X檀黑体e体呈乌木色，黑亮IIIR黑体b体呈深色IIL黄身y体呈浅橙黄色X残翅vg翅退化，部分残留不能飞IIR焦刚毛sn刚毛卷曲如烧焦状X小翅m翅较短X5、果蝇的性别决定染色体组成2n＝8。核内有丝分裂：不涉及细胞分裂和核分裂的染色体分裂方式。体联会：一些特殊的体细胞中（果蝇唾腺细胞）染色体经多次复制却不分开，常染色体上有决定雄性果蝇的性别决定XY育性有关。YY比值（性指数）有关。X/A=1则为雌性；X/A=0.5则为雄性。X/A＞1，为超雌；X/A＜0.5，则为超雄；0.5＜X/A＜1则为中间性。X平衡。果蝇的连锁群一对染色体。三、材料和器材1、实验材料：黑腹果蝇。2、实验仪器及用具：双目解剖镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、白瓷板、新毛笔等。3、药品和试剂：果蝇培养基、乙醚等。四、实验方法和步骤1、培养基的配制果蝇培养基的配置(1000ml用量)玉米面玉米面红糖琼脂干酵母丙酸85g（或蔗糖）65g 8.5g7g5ml水溶琼脂→加红糖（或蔗糖）→加搅好的玉米面→煮沸→加水到冷却→50℃左右加入酵母粉丙酸（防腐剂。配制好的培养基进行高压灭菌，121℃，20min，待用。2、果蝇培养3-5视其生长周期。3、果蝇的性状观察对果蝇进行检查时，可用乙醚麻醉，使它保持静止状态。因为果蝇对乙醚很敏感，易麻醉，麻醉的深度看实验的要求而定（45。条，盖上瓶塞，稍等片刻果蝇便麻醉。4、记录观察结果观察完毕，将全部果蝇倒入煤油或酒精瓶中（死蝇盛留器，统一处理。五、实验报告将观察到的果蝇常见突变形状特征填在下表中。++eywBwyvg勺翅缺刻三隐性体色眼色形翅形刚毛实验四果蝇的伴性遗传一、实验目的1、正确认识伴性遗传的正、反交的差别，进一步认识伴性遗传的特点。2、记录杂交结果，掌握统计处理方法。二、基本原理遗传方式称为伴性遗传（sex-linkedinheritance。XYXX，XY，性别。伴性基因主要位于XYX—连锁遗传。果蝇的红眼与白眼是一对相对性状，由单基因控制，位于X染色体上，基因之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇（♀）和白眼果蝇（♂）杂交，F代中的果蝇均为红眼，F1

代中红眼果蝇∶白眼果蝇=3∶1，但在雌果蝇中全为红眼，在雄果蝇中红眼果蝇∶白眼果蝇=1∶1。当反交时，F1

代中的雌果蝇为红眼，雄果蝇却为白眼。F2

代中红眼果蝇∶白眼果蝇=1∶1，在雌果蝇或雄果蝇中红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为1∶1。ABAA：红眼雌[♀]×白眼雄[♂] B：白眼雌[♀]×红眼雄P： X+X+×XwY P： XwXw×X+Y↓ ↓F1： X+Xw×X+Y F1： X+Xw×XwY↓ ↓F2：

X+Xw

X+Y XwY F2：

XwXw

X+Y XwY表型:♀[+]♀[+]♂[+]♂[w] 表型:♀[+]♀[w]♂[+]♂[w]注意：12XBF1千个体中有一个。不分离现象如下图所示：三、材料和器材1、实验材料：黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster ）品系野生型（红眼X+X+X+Y突变型（白眼2、实验仪器及用具：大试管、麻醉瓶、瓷板、毛笔等。3、药品和试剂：乙醚、果蝇培养基等。四、实验方法和步骤1、收集处女蝇：由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。由于孵化出的12（8不交尾♀、♂蝇分开培养，所得的♀蝇即为处女蝇。2、准备好培养基，按正、反交组合，把已麻醉的红眼♀、白眼♂和红眼♂、白3—5杂交日期、操作者姓名。3、6—7F1

幼虫出现，即除去亲本果蝇（。43—4F1

成蝇的性状（正、反交有什么不同？眼色与性别的关系如何？。5、将所出现的F1

3—5（此处无需处女蝇。两组合后代不能混合，应分别培养。6、6—7F1

代亲本果蝇。73—4，F2

代成蝇出现，麻醉后倒出观察眼色和性别，进行统计。合计比例8合计比例F1代正交反交类型红眼♀×白眼♂白眼♀×红眼♂观察日期红眼♀ 红眼♂红眼♀ 白眼♂型红眼白眼红眼白眼红眼白眼红眼白眼观察♂♂♀♀♂♂♀♀日期F代类2正交组合FF代类2正交组合F2反交组合F2合计比例χ2=∑（观察值–理论值）2/理论值根据χ2测定，查χ2表，n=4-1=3，P

=7.815;n=2-1,P

=3.841。若所得的0.05 0.05χ2﹤P ，可以认为观察值是符合假设的。具体对这个实验来说，所得到的实验0.05结果应该是符合伴性遗传的假设，也就是说眼色的这对性状是由位于性染色体X上的一对等位基因控制的。若所得的χ2﹥P遗传的结果。

则说明所得到的结果不符合伴性0.05，五、实验报告1、完成上面的统计表格，并做χ2测验，解释实验结果。2、在杂交过程中，当见到有F1

幼虫出现时为什么一定要将亲本果蝇去除干净？3、在挑取F1

代果蝇进行继续杂交时为什么不需要处女蝇？实验五果蝇唾腺染色体制片技术一、实验目的1、练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法;2、观察果蝇唾腺的形态学及遗传学特征；3、了解体细胞染色体配对现象；二、基本原理本世纪初，D.KostoffD.melanogaster细胞核中发现了特别巨大的染色体—唾液腺染色体（salivaryglandchromosom。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。仍不断地进行自我复制而不分开1000—40005μm，400μm中期相染色体大得多（约100—150倍（polytenechromosom）和巨大染色体（giantchromosom。“体细胞联会只呈现单倍数2n=2×4，其中第Ⅱ、第Ⅲ染色体为中部着丝粒，第Ⅳ和第Ⅰ（X染色体