碱性蛋白酶活力测定

碱性蛋白酶活力测定1定义1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1^g酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。2福林法2.1原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。2.2试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（NaCO）21.2g，用水溶解并定容至500mL。2 3三氯乙酸（CCl3・COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.05mol/L按GB601配制。2.2.5硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。上述缓冲溶液，需用pH计校正。10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。100Pg/mLL-酪氨酸标准溶液称取预先于105^干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100Pg/mLL-酪氨酸标准溶液。2.3仪器和设备2.3.1恒温水浴（40±0.2）°C2.3.2分光光度计应符合GB9721的规定。2.4分析步骤2.4.1标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液 按附表1配制。表1L-酪氨酸标准溶液管号L-酪氨酸标准溶液的浓度c/（Pg/mL）取100四g/mL酪氨酸标准溶液的体积V/mL取水的体积V/mL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL（需做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，置于（40±0.2）°C水浴中显色20min,取出，用分光光度计与波长680nm,100mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（四g），即为吸光常数K值。其K值应在95〜100范围内。2.4.2测定酶液制备：精确称取十酶粉1g（±0.001），加入10mL缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。吸取滤液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）a・先将酪素溶液放入（40±0.2）C恒温水浴中，预热5min。b.按下列程序操作：试管A（空白）| 试管B（酶试样，需做3个平行试样）! !加酶液1.00mL 加酶液1.00mL

|(40±0.2)°C,2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,2min加酪素1.00mL(摇匀)|(40±0.2)°C,2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,2min加酪素1.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,10minI(40±0.2)C,10min加酪素1.00mL（摇匀）I离心（5000r/min,5min）I取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mLI于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度加三氯乙酸2.00mL（摇匀）I离心(5000r/min,5min)I~~取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mL广于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度2.5计算X=AXKX4/10Xn=2/5XAXKXn式中X-样品的酶活