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文档简介

碱性蛋白酶活力测定1定义1克固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1^g酪氨酸为1个酶活力单位,以u/g(u/mL)表示。2福林法2.1原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下,水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光光度法测定,计算其酶活力。2.2试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(NaCO)21.2g,用水溶解并定容至500mL。2 3三氯乙酸(CCl3・COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g,用水溶解并定容至500mL。氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L按GB601配制。2.2.5硼酸缓冲溶液(pH10.5)甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀,用水稀释至1000mL。上述缓冲溶液,需用pH计校正。10g/L酪素溶液称取酪素1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后,加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100mL容量瓶中,用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内储存,有效期为3天。100Pg/mLL-酪氨酸标准溶液称取预先于105^干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.002g,用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸定容至100mL,即得到100Pg/mLL-酪氨酸标准溶液。2.3仪器和设备2.3.1恒温水浴(40±0.2)°C2.3.2分光光度计应符合GB9721的规定。2.4分析步骤2.4.1标准曲线的绘制a.L-酪氨酸标准溶液 按附表1配制。表1L-酪氨酸标准溶液管号L-酪氨酸标准溶液的浓度c/(Pg/mL)取100四g/mL酪氨酸标准溶液的体积V/mL取水的体积V/mL000101101922028330374404655055b.分别取上述溶液各1.00mL(需做平行试验),各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL,置于(40±0.2)°C水浴中显色20min,取出,用分光光度计与波长680nm,100mm比色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度,以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(四g),即为吸光常数K值。其K值应在95〜100范围内。2.4.2测定酶液制备:精确称取十酶粉1g(±0.001),加入10mL缓冲液(2.2.5),在小烧杯中溶解,并用玻璃棒搅拌,静置片刻后,将上层液小心倾入容量瓶中,沉渣部分再加入少量缓冲液,如此反复搅拌溶解4次,最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度,充分摇匀,用四层纱布过滤。吸取滤液5mL,移入100mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,所得液位稀释2000倍的酶液。(稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活)a・先将酪素溶液放入(40±0.2)C恒温水浴中,预热5min。b.按下列程序操作:试管A(空白)| 试管B(酶试样,需做3个平行试样)! !加酶液1.00mL 加酶液1.00mL

|(40±0.2)°C,2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,2min加酪素1.00mL(摇匀)|(40±0.2)°C,2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,2min加酪素1.00mL(摇匀)I(40±0.2)C,10minI(40±0.2)C,10min加酪素1.00mL(摇匀)I离心(5000r/min,5min)I取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mLI于680nm波长,用10mm比色皿测其吸光度加三氯乙酸2.00mL(摇匀)I离心(5000r/min,5min)I~~取1.00mL滤液I加碳酸钠溶液5.0mLI加福林试剂使用液1.00mL广于680nm波长,用10mm比色皿测其吸光度2.5计算X=AXKX4/10Xn=2/5XAXKXn式中X-样品的酶活

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