菌种对孔雀绿染料的降解实验课件

菌种对孔雀绿染料的降解实验前言印染工业是世界上最大的工业之一,它包括纺织业、皮革、化妆品、纸业、印刷业、塑料制造、制药和快餐业等,同时它也是世界上最大的污染源之一。如果染料废水被排到河水中会对水生生物的肝脏、鳃、肾脏、肠、生殖腺、腺垂体细胞产生有害的影响。因此,染料的降解已经被认为是纺织业废水处理的一个非常重要的问题。各种各样的物理或化学方法已经被用于染料废水的处理,如吸附、离子交换、凝聚、膜过滤、臭氧法等。用物理化学方法除去孔雀石绿相对来说过程复杂、耗时且效率不高。而生物方法因其是一种环境友好型的处理方式,日益受到人们的关注。孔雀绿(MalachiteGreen,MG)是一种已经被广泛应用于工业的三苯甲烷类染料,它影响人类的免疫系统、生殖系统,是一种具有致癌性的有毒物质。另外,直接接触孔雀石绿会刺激皮肤、损伤眼睛。孔雀石绿已经被美国食品与药物管理局提名为首要的致癌化学物质，并且已经被一些国家和美国食品与药物管理局禁止使用。本实验从活性污泥和土壤中筛选出分离染料的高效菌，对其进行分离、纯化和驯化后以孔雀绿染料作为底物进行降解实验，观察不同菌种对孔雀绿的脱色效果，最终确定高效脱色菌种。01PART01PART02PART03实验设计方案与思路实验方法结果与讨论PART03实验结论1231实验设计方案与思路1.1孔雀绿的标准曲线制定1.2活性污泥和土壤中菌种的分离纯化1.3单菌种的扩大培养1.4不同单菌种对染料的降解实验1.5对菌种进行初步鉴定1232实验方法2.1孔雀绿的标准曲线制定配制浓度为216mg/L的孔雀绿标准溶液，在8支50ml容量瓶中各加入该标准溶液0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL，用水稀释至刻度、摇匀。在紫外分光光度计上于波长617nm处，以水为参比，测定吸光度值。利用所测得的标准系列的吸光度值对浓度作图，绘制标准曲线。1232.2活性污泥、土壤和底泥中菌种的分离纯化2.2.1培养基制备、灭菌（1）实验用具灭菌：将实验需要用到的培养皿清洗干净后用报纸包装好放入灭菌锅灭菌。（2）培养基配方：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，琼脂15~20g，淀粉2g，蒸馏水1000mL，pH：7.4~7.8。灭菌条件：0.103MPa（121℃,15~20min）（3）按照配方将培养基溶液煮好后倒入干净的大锥形瓶中，塞上棉塞，用报纸包装好锥形瓶口后放入灭菌锅灭菌。（4）灭菌结束并冷却后在无菌操作台中将培养基溶液倒入6个培养皿中，倒入的培养基溶液应不超过培养皿的1/2，待培养基凝固后即成平板，最后将制好的平板放到37℃恒温培养箱培养7天。2实验方法1232.2.2活性污泥中菌种的分离纯化活性污泥中菌种的分离纯化采用平板划线法。在无菌操作台中，将平板倒置于酒精灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着酒精灯(这时皿盖朝上，仍留在酒精灯旁)，右手拿接种环在酒精灯上烧红之后再挑取一环活性污泥伸入培养皿内，先在平板上轻轻划一折线（切勿划破培养基），转动培养皿，并将接种环上残菌烧掉，冷却后使接种环从第一次画的折线的末端开始做第二次折线划线，同法做第三、第四次划线。划线完毕（如上图）盖好皿盖，倒置于37℃恒温培养箱培养7天后观察结果。（实验将三个平板用于活性污泥菌种的分离纯化，做好标签）2实验方法1232.2.3土壤中菌种的分离纯化担心土壤中的菌太少，用平板划线法可能导致接种到的菌太少不明显，于是采用平板表面涂布法来对土壤中的菌种进行分离纯化。（1）将采来的样本土壤在烧杯中加水充分搅拌溶解成土壤溶液。（2）涂布：在无菌操作台中，将三角刮刀在酒精灯上烧热并冷却后在土壤溶液中轻轻浸泡一下保证三角刮刀上沾有土壤溶液，最后用沾有土壤溶液的三角刮刀在平板上旋转涂布均匀，盖上皿盖。（3）培养：将涂布完毕的培养皿（实验将三个平板用于土壤溶液的涂布，做好标签）送到37℃恒温培养箱培养7天。（4）观察：待长出菌落，观察实验结果。2实验方法1232.2活性污泥、土壤和底泥中菌种的分离纯化2.2.1培养基制备、灭菌（1）实验用具灭菌：将实验需要用到的培养皿清洗干净后用报纸包装好放入灭菌锅灭菌。（2）培养基配方：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，琼脂15~20g，淀粉2g，蒸馏水1000mL，pH：7.4~7.8。灭菌条件：0.103MPa（121℃,15~20min）（3）按照配方将培养基溶液煮好后倒入干净的大锥形瓶中，塞上棉塞，用报纸包装好锥形瓶口后放入灭菌锅灭菌。（4）灭菌结束并冷却后在无菌操作台中将培养基溶液倒入6个培养皿中，倒入的培养基溶液应不超过培养皿的1/2，待培养基凝固后即成平板，最后将制好的平板放到37℃恒温培养箱培养7天。2实验方法1232.3单菌种的扩大培养（1）液体培养基的制备、灭菌：按照培养基配方（不加琼脂，其他相同）将培养基溶液煮好后稍冷却倒入7个锥形瓶中，7个锥形瓶中的溶液的量应相同，均为100mL。用棉塞塞住锥形瓶并用报纸包装好后将它们置于灭菌锅中进行灭菌。灭菌结束并冷却后即可得到液体培养基。（2）接种:把7个液体培养基置于无菌操作台中，将上回活性污泥和土壤分离纯化的6个平板从培养箱中取出。在无菌操作台内从3个活性污泥和3个土壤分离纯化的平板形成的多个菌落中各找出明显不同的三个菌落，并将这6种菌落分别接种到6个液体培养基中进行扩大培养，做好标签“土壤①”“土壤②”“土壤③”“活性①”“活性②”“活性③”，剩余一液体培养基不接种菌落，作为无菌空白对照组。具体操作如下：把接种环在酒精灯上烧红后，挑取一环菌落在液体培养基中充分搅动确保该菌落进入液体培养基。（3）培养：接种完后将7瓶液体培养基置于37℃恒温培养箱中培养6天。2实验方法1232.4不同单菌种对染料的降解实验在无菌操作台内往7个锥形瓶的菌种液体培养基中加入等量的少量的孔雀绿染料，置于恒温培养箱中培养2天后，将7个锥形瓶的菌种液体培养基倒入7个离心管中进行离心后，在紫外分光光度计上于波长617nm处，以液体培养基溶液为参比，测定吸光度值。根据吸光度值算出脱光率，最后根据脱光率，确高效脱色菌种。2实验方法1232.5对菌种进行初步鉴定对这六种菌进行革兰氏染色观察菌种的形状和菌属。（1）涂片、固定取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作记号，用胶头滴管滴一滴含菌溶液于载玻片中央。将载玻片置于微小火焰上方烘干。烘干后再在火焰上方快速通过3~4次，使菌体完全固定在载玻片上。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。（2）初染滴加草酸铵结晶紫染色液染色1~2min，水洗。（3）媒染滴加革兰氏碘液，染1~2min，水洗。（4）脱色滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后即水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾去乙醇，如此重复2~3遍后即水洗。（5）复染滴加番红染液，染2~3min，水洗并使之干燥。（6）镜检按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录并根据呈现的颜色判断该菌属是阳性菌还是阴性菌。2实验方法3结果与讨论3.1孔雀绿的标准曲线制定3结果与讨论3.2不同菌种对染料的降解实验

由表格中的数据可以看出不同菌种对孔雀绿染料的脱光率中，“土壤③”菌种的脱光率是最高的，可以初步确定为高效脱色菌种。但由于实验误差导致菌种脱光率出现大于100%的情况，经讨论，造成该误差可能的原因为：在用紫外分光光度计测吸光度步骤中，所采用的参比溶液不正确。在实验过程中我们是用液体培养基溶液作为参比的，但实际上在用液体培养基对菌种进行扩大培养一段时间后，作为碳源的淀粉，可能早已被菌种消耗完了，所以应选不含淀粉的液体培养基溶液作为参比。3结果与讨论3.3对菌种进行初步鉴定活性污泥①长细丝状革兰氏染色阳性