固定化酶及固定化技术

固定化酶及固定化技术第一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶：在水溶液中－不稳定一次性使用-难回收，难连续化生产用于医药/化学分析－纯度要求高产物的分离纯化困难。。。。－－－要求将酶变成不溶性－－－实际上将酶限制在一定空间固定化第二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定酶具有催化活性1916年，美国科学家发现，酶和载体结合以后，在水中呈不溶解状态时，仍然具有生物催化活性。

固定化酶可重复使用——操作稳定性

酶在固定化后其活力可以缓慢释放,酶的稳定性比天然状态高,可重复多次使用.第三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五结果如图所示:固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15%,由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性例:将0.5gDEAE纤维素固定化壳聚糖酶与10mL1%壳聚糖溶液在60℃下连续反应10次每次反应时间为6h每次反应后分别测定酶活力第四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五一、固定化酶（immobilizedenzyme）水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶（固定化酶）什么是固定化酶？第五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发挥催化作用的酶制剂。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（化学偶联）及包埋等多种方法。

第六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五与固定化酶技术相配套的是酶生物反应器同一般的化工容器一样，需要对酶反应器温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是，酶反应器必须进行无菌操作。酶生物反应器第七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五简史1916年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith第一次实现了酶的固定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，Immobilizedenzyme第八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五1973年，固定化微生物的应用——固定化大肠杆菌中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸1976年，固定化酵母细胞生产啤酒和酒精1978年，日本用固定化细胞生产酶——固定化枯草杆菌生产淀粉酶1979年，固定化植物细胞和动物细胞开始研究1982年，日本首次研究用固定化原生质生产氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生质研究第九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五第十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五二、固定化酶的优缺点：稳定性高；酶可反复使用；产物纯度高，极易将固定化酶与底物、产物分开；固定化酶的反应条件易于控制生产可连续化和自动化，节约劳动力；设备小型化、可节约能源。

固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：第十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五缺点：固定化所需载体和试剂较贵，成本高，投资大固定化时，酶活力有损失长期生产，易污染，载体易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应第十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五三、固定化酶制备必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸残基不发生变化）避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化时要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。基本原则：第十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化应该有利于生产自动化、连续化。载体能抗一定的机械力。固定化酶应有最小的空间位阻。酶与载体必须结合牢固，利于固定化酶的回收及反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。第十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶的固定化方法四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）第十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五

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指通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶吸附到固体吸附剂表面的方法。

优点：操作条件温和，固定化时酶分子的构象较少或者不变化；载体廉价易得缺点：结合力弱，易解吸附选择载体的原则（1）要有巨大的比表面积（2）要有活泼的表面（3）便于装柱进行连续反应。1.物理吸附法SMS:一种硅酸盐载体有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶无机载体：氧化铅、皂土、白土、

高岭土、多孔玻璃、

硅藻土、二氧化钛等第十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五2.结合法离子键结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法。阴离子交换剂：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，AmberliteIRA-93，410，900；

阳离子交换剂：CM-纤维素，AmberliteCG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。第十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五使用注意：pH、离子强度、温度离子结合法的操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。第十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。归纳起来有二类：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。(与交联法合用）共价结合法第十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶蛋白的侧链基团和载体表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法。第二十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体第二十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五首先载体上引进活泼基团

然后活化该活泼基团最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键关键共价键结合法制备固定化酶的“通式”载体活化—活化基团＋酶分子基团第二十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶分子和载体连接的功能基团：酶蛋白N-端的α-氨基或赖氨酸残基的氨基酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的ß-和γ-羧基Cys残基的巯基Ser、Tyr、Thr残基的羟基Phe、Tyr残基的苯环His残基的咪唑基Trp残基的吲哚基第二十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五第二十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五第二十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．硅烷化法E．溴化氰法载体活化的方法第二十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比：优点：酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点：该方法反应条件苛刻，操作复杂；由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。只能用于酶，不能用于微生物的固定化第二十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五3.交联法——是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法交联法使用的交联剂是戊二醛、己二胺、双偶氮苯等水溶性化合物。第二十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五戊二醛的两个醛基都可以与酶或者蛋白质的游离氨基酸反应，形成Schiff碱，从而使酶或者菌体蛋白交联，形成固定化酶或固定化菌体。第二十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五例：采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，效果明显。第三十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。单独使用交联法所得到的固定化酶颗粒小、机械性能差，酶活低，故常与其他方法联用第三十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子:

（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶

（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第三十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五4.包埋法是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。网格型；微囊型。第三十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五网格法——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第三十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五第三十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五微囊型半透膜包埋法（微囊化法）：将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等第三十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。微囊发生器第三十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五第三十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五酶的固定化模式第三十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶第四十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五没有一个方法是十全十美的包埋、共价结合、共价交联三种虽结合力强、但不能再生、回收；吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差，在受到离子强度、pH变化影响后，酶会从载体上游离下来。包埋法各方面较好，但不适于大分子底物和产物。第四十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五其他固定化酶方法结晶法：分散法：热处理法等等第四十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五判断固定化方法的优劣及其固定化酶的实用性的指标有:

(1)相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值通常高于75%

(2)酶的活力回收率固定化酶的总活力与用于固定化的酶的活力之百分比称为酶的活力回收率。一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果.

(3)固定化酶的半衰期衡量操作稳定性的关键.

第四十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题：酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大固定化颗粒成型困难

第四十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化技术的改进定点固定化技术

抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）多酶系统的共固定化多种酶同时固定在膜材料上,利用各自的功能协同催化复杂的生物转化过程新型的固定化技术高分子技术、纳米技术、光、辐射等作用

加入表面活性剂

可使酶活性大幅度提高，最高的达100

倍，并增加了酶使用次数等等第四十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化对反应系统的影响不同制备方法，对酶反应系统产生的影响不同假定：酶固定化后，在载体表面或多孔介质中的分布完全均质整个系统各相同性四、固定化酶性质的变化：第四十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五(一）影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质及相互作用。

第四十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五成分参数酶生物化学性质：分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数：专一性，pH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pH，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载体化学特征：化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性

机械性质：颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。固定化酶固定化方法：所结合的蛋白,活性酶的产量,内在的动力学参数质量转移效应:分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性:操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性效能:生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）第四十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五包括：酶本身的变化:

主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化;载体的影响：

在固定化酶的周围，形成了能对底物产生立体影响的扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。载体与酶的相互作用：

载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结构、封闭酶活性部位等。第四十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五改变之一：构象改变、立体屏蔽构象改变：

酶分子构象发生某种扭曲，导致酶与底物结合能力或催化能力下降立体屏蔽：

固定化后，使得酶的活性中心或调节部位造成某种空间障碍，使得效应物或者底物与酶的临近或者接触受到干扰第五十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五改变之二：分配效应、扩散限制微环境：

微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。分配效应：

由于载体性质，造成底物和效应物等在微观体系和宏观体系之间的不等性分配，从而影响酶促反应速度第五十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五扩散限制效应：底物、产物和效应物等，在环境中的迁移运转速度收到限制DEAE纤维素固定化壳聚糖酶:以DEAE纤维素为载体戊二醛为交联剂固定壳聚糖酶第五十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五改变之三：微扰由于载体的亲水、疏水作用和介质的介电常数等性质,直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力第五十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五1.固定化后酶活力的变化固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。例如：

用羧甲基纤维素载体固定的胰蛋白酶消化不同底物：

酪蛋白（高分子）－－原酶活力的30%

苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺(低分子)－原酶活力的80%。一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。第五十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五原因：酶结构的变化空间位阻不过，也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高，原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。第五十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：①酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；②固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。第五十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现：30种酶稳定性提高，12种酶无变化，8种酶稳定性降低。然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。2.固定化对酶稳定性的影响第五十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化后酶稳定性提高的原因可能有以下几点：①固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。②酶活力的缓慢释放。③抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解第五十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化青霉素酰化酶将酶于0.05mol／L的PBS（pH7.5）中分别在不同温度下保温6小时，冷却后测定酶活力。固定化酶的热稳定性优于自然酶。固定化酶的稳定性变化固定化酶；2.自然酶a.热稳定性提高第五十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五测试结果:5天后其活性仍可保留96%.例:将DEAE纤维素固定化壳聚糖酶浸泡在95%的乙醇中，连续5天测其催化活性b.对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高第六十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性，使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成为可能。提高酶对某些抑制剂的稳定性可以预计，今后固定化酶在有机合成中应用会进一步发展。第六十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五c.对pH的稳定性提高青霉素酰化酶在不同pH值的缓冲液中，于37℃保温16h测定酶活力。固定化酶在pH5.5-10.3活力稳定；游离酶则仅在pH7.0-9.0稳定。固定化酶的pH稳定性明显优于游离酶。第六十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五d.对蛋白质水解酶的抗性固定化后载体与酶的紧密连接对其起一定保护作用,并在空间上阻碍酶与大分子物质接近,从而降低了酶与大分子物质结合的几率,防止酶被其他蛋白酶水解.第六十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五此外：有些固定化酶经过贮藏，可以提高其活性。

大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4℃下，120天酶活力无变化。第六十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五对操作稳定性都有影响第六十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五如图：固定化酶的最适温度为60°C，而游离酶的最适温度为50°C而固定化酶在50-65°C范围内都保持了较高的酶活力,这说明壳聚酶经固定化后其在较高温度下的适应范围有了明显提高3.固定化酶的最适温度的变化固定化后，酶的热稳定性提高，所以固定化酶的最适温度提高当然，也有报道最适温度不变或下降的。第六十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五4.最适pH值的变化酶的催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和pH-活性曲线常常发生偏移。第六十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五pH对固定化酶的影响1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对体系pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH值；反之则低第六十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五例:取0.2gDEAE纤维素固定化壳聚糖酶与5mL壳聚糖酶液各8份分别于不同pH下测定固定化酶和游离酶的活力可见：固定化酶的最适pH向酸性偏移第六十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五例：取0.15g固定化黄曲霉毒素解毒酶和4ML黄曲霉毒素解毒酶液各8份，分别于不同pH下测定固定化酶和游离酶的活力可见：固定化酶的最适pH向碱性偏移第七十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五影响固定化酶Km的因素：1.酶的空间立体障碍载体为电中性时，由于扩散限制造成表观Km上升。2.电荷效应（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km'<Km3.溶液的离子强度5.固定化酶的米氏常数（Km）变化第七十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五例：取DEAE纤维素固定化壳聚糖酶0.2g与1%壳聚糖酶液5mL各6份分别加入2mL不同浓度的壳聚糖溶液(0.4%1.5%)于50°C水浴中保温60min测定还原糖浓度，用双倒数作图求得米氏常数

如图：经线性拟合可求得Km(固)=18.87g/L

Km(游)=2.49g/L第七十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五本实验中选用的载体DEAE纤维素和底物壳聚糖所带电荷相反使得Km值降低；酶固定化后产生的空间立体障碍或扩散阻力使得Km值升高,从实验结果可以得出固定化过程中载体所带的电荷的极性对本实验室所提取的壳聚糖酶的米氏常数的影响较酶经固定化后所产生的空间扩散阻力对酶的米氏常数的影响小，所以最后酶Km提高。第七十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五五、评价固定化酶的指标一般评价：1．酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。2.酶比活定义（游离）：每毫克所具有的酶活力单位第七十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化酶1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）第七十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五3.偶联效率以载体结合酶量(或酶活力)的百分数表示：由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。第七十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五4.活力回收酶固定化—般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收率。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力第七十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五六、固定化细胞利用胞内酶制作固定化酶时，需要破碎细胞，然后提取酶，这就增加了工序和成本。科学家设想直接固定含所需胞内酶的细胞固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于：保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定。保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生。

第七十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五20世纪70年代，科学家研制成固定化细胞，并且用于生产。例如，将酵母菌细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母菌细胞，可以用于酒类的发酵生产固定化增殖细胞发酵更具有显著优越性第七十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化细胞分类、形态特征和生理状态：分类方式固定化细胞类型细胞类型微生物、植物、动物生理状态死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞第八十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五形态特征：固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相同）等，目前大多数制备成颗粒状珠体，这是因为：不规则形状的固定化细胞易磨损，在反应器内尤其是柱反应器内易受压变形，流速不好，圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所以生产效率相对较高。第八十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。无论用海藻酸钙、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶包埋，都有类似情况。形成“凹池”的原因尚待进一步研究。第八十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化死细胞：一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。第八十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。第八十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化增殖细胞又称固定化生长细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。第八十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五与固定化酶和固定化死细胞比较固定化增殖细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不解体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以说，固定化增殖细胞在发酵工业中最有发展前途。第八十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化增殖细胞发酵的优越性1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体

2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用

3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。(膜的选择通透性）

4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应5、抗污染能力强第八十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化细胞技术的局限性：(1)必须保持菌体完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。(3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用,载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性.(4)如利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；但这些缺点并不影响它的实用价值。第八十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化酶与细胞的选择依据：对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂。要根据过程本身来决定。一般说:对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适。对多步转换，采用整细胞显然有利。缺点：固定化后的细胞不易与反应物接近，可能导致反应效果下降第八十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化微生物和动植物细胞的应用固定化微生物细胞：用于生产酒类、氨基酸、有机酸、抗生素以及酶和辅酶，也可以用于有机溶剂生产，废水处理等固定化植物细胞：主要用于生产人工种子、香精、色素、药物、酶等固定化动物细胞主要用于生产疫苗第九十页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五七、固定化酶的应用

1、在工业上的应用用固定化酶可以生产L-氨基酸，葡萄糖及葡糖浆、核苷酸、半合成的抗生素母核等L－氨基酸的生产：用固定化酶（氨基酰化酶）折分DL－氨基酸可连续生产L－氨基酸。如固定化的细胞（大肠杆菌）生产L－Asp：以120L柱式反应器60天可生产5吨的L－Asp。第九十一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五乙酰-DL-AlaL-Ala+乙酸 乙酰-D–Ala（A-D-Ala）Aminoacylase氨基酰化酶第九十二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第九十三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五固定化酶用于水解牛奶中的乳糖

牛奶中含有4．3％-4．5％的乳糖，乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后将导致不良后果。用乳糖酶可以将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反应器可以连续处理牛奶，将乳糖分解乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处理后，可以防止其在冰激淋类产品中结晶．改善口感。第九十四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五严重肾脏疾病，需血液透析。过滤尿素和尿酸等代谢废物利用固定化脲酶透析液和活性碳构成的体外循环装置固定化脲酶：脲酶与离子交换树脂通过微囊法制备而成的脲酶水解尿素为氨和CO2，氨被树脂吸附，CO2由肺呼出，其他代谢物由活性碳吸附2.在医药治疗上的应用人工肾：第九十五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五治疗癌症正常细胞：L-Asn合成酶，Asn被消耗的同时不断合成维持细胞蛋白质合成需要癌细胞：缺少活无L-Asn合成酶，Asn被消耗，影响蛋白质合成，细胞“饿死”用固定化的天冬酰胺酶治疗白血病第九十六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五利用尼龙或尿素聚合物半透膜制备成微囊型L-天冬酰胺酶,用于白血病治疗。改变了酶的最适pH；微囊型酶对蛋白酶稳定；注射到大白鼠腹腔内，急性毒性很低、也不会产生抗体；除制成微囊型外，还有人采用酶管或酶板形式进行体外循环治疗，也达到了预期的疗效。第九十七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五微囊型固定化酶将酶包埋在半透膜性质的聚合物内，制成所谓的微囊型固定化酶。小分子底物或产物可自由地透过胶囊的半透膜，而酶作为大分子则不能透过胶囊；此外，胶囊外的一些蛋白质、酶、抗体等高分子物质也不能进入胶囊内部，这就避免了发生过敏性反应。

第九十八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五

胶囊型固定化酶的另一大优点是，胶囊内的酶仍以溶解状态作用于底物。因此突破了狭义的固定化酶的定义，也为固定化酶应用于临床提供了可能性。

与此同时，人们采用人血清白蛋白替代尼龙、硝酸纤维等作为制造胶囊的材料，使包装材料更具有安全、稳定和体内易代谢等特点。第九十九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五

是一种与x染色体连锁的遗传代谢病

患者由于先天性缺乏HGPRT，导致体内次黄嘌呤和鸟嘌呤补救途径的障碍，并进而引起肾结石、痛风。

Lesch-Nyhan综合症第一百页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五

Chang等人利用微囊型嘌呤氧化酶治疗Lesch-Nyhan综合症，使次黄嘌呤的水平显著下降，同时发现次黄嘌呤能很快地进入微囊体中并被代谢。在以两岁半大的病孩所做的临床试验中，他们也发现效果很好。第一百零一页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五药物控释载体：新的药物（包括化学合成药、天然药物及基因工程药物）不断问世，但将它们应用于临床却并不很顺利：很多药物尤其是蛋白质类药物，口服易被胃酸破坏或沉淀；单纯注射后瞬时血药浓度升高，但马上被肝脏及血液中的酶系统所清除，需要反复注射，不仅增加治疗费用，而且增加了感染的机会；肿瘤化疗用细胞毒性物质选择性较差，全身毒副作用严重；有些药物如反义核酸亲水性强难于穿过细胞膜；蛋白质类药物容易引起免疫反应；很多药物稳定性差，不耐贮存。第一百零二页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五以上问题往往不能用简单的药物改构来完成，因此，为药剂学工作者提出了严峻的任务。近30年来，药物的新剂型发展很快，已逐步建立了基于药物理化性质及作用特点的合理给药体系，其核心特点是从时间和空间分布上控制药物的释放。

第一百零三页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五在肿瘤的化学治疗及重组蛋白质类药物制剂中比较重要的几种控释体系有聚合物修饰、凝胶包埋、微球、脂质体及免疫导向等。这几种控释体系都涉及到将药物与聚合物载体偶联或固定于某种聚合物载体上，因此也可称为载体药物第一百零四页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五聚合物修饰多用于蛋白质类药物。这类药物生物半衰期短、免疫原性强，可用适当的水溶性高分子聚合物加以修饰以改善其性能。羧甲基壳聚糖对天门冬酰胺酶的修饰,聚乙二醇对原核表达重组人血小板生成素分子的修饰等，均可起到降低毒性、延长半衰期的作用。此外，小分子药物也可使用这一系统，如将抗癌药，羟基硫胺素及氨甲蝶呤偶联于羧甲基纤维素后注射，可使荷瘤小鼠平均生存时间较对照组延长2倍左右。第一百零五页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五凝胶包埋即用生物相容性好的高分子聚合物与药物混合制成含有药物的凝胶，植入体内特定部位，以达到缓释给药的效果。药物从凝胶中释出后，经周围组织吸收，然后进入血液循环或直接局部作用，避开了首过效应，生物利用度高，作用时间长。第一百零六页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五微球制剂用高聚物微球包埋或化学偶联药物可制成微球制剂，它具有：靶向性、缓释性及减少抗药性等特点。微球与靶细胞接触，可以通过胞饮进入胞内发生作用，不影响细胞膜通透性，不会产生抗药性。第一百零七页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五早期使用的微球制剂为不被生物降解的，多为口服制剂。现在用于注射的多为可生物降解小于1m的微球，如以生物可降解微球包埋入生长激素肌注动物，血药浓度稳定、不产生抗体，注射部位组织无病变。微球还可用于基因治疗及基因疫苗的载体。第一百零八页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五脂质体

-----磷脂双分子层在水溶液中，自发形成的超微型中空小泡。第一百零九页，共一百二十四页，编辑于2023年，星期五

现查明是因缺乏氨基己糖酶A，使神经节苷脂累积在组织内，从而出现神经迟钝、肌肉无力、失聪、视网膜有樱桃红点等症状.