小肠结肠炎耶尔森氏菌

食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验范围本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。标准性引用文件以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单(不包括订正的内容)或均不适用于本标准，然而，鼓舞依据本标准达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本标准。GB／T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验设备和材料除微生物试验室常规无菌及培育设备外，其他设备和材料如下：3.1 冰箱：2℃～5℃。3.2 恒温培育箱：26℃±l℃、36℃±l℃。3.3 显微镜：l0×～l00×。均质器或灭菌乳钵。0.1g。灭菌试管：16mm×160mm、15mm×100mm。灭菌吸管：1mL(0.01mL刻度)、10mL(0.1mL刻度)。灭菌锥形瓶：200mL、500mL。90mm。全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK。培育基和试剂改进磷酸盐缓冲液：见第A.1章。CIN-1培育基：见第A.2章。改进Y培育基：见第A.3章。改进克氏双糖培育基：见第A.4章。糖发酵管：见第A.5章。鸟氨酸脱羧酶试验培育基：见第A.6章。半固体琼脂：见第A.7章。缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)V—P试验用]：见第A.8章。碱处理液：见第A.9章。尿素培育基：见第A.10章。API20E生化鉴定试剂盒或VITEKGNI+生化鉴定卡。检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1 小肠结肠炎耶尔森氏茵检验程序操作步骤增菌以无菌操作称取25g(或25mL)样品放入含有225mL改进磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均8000r／minlmin1min。液体样品或粉末状样品，应26℃±l48h～72h。碱处理除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5mL4.5mL充分混合l5s。分别CIN-1琼脂平板和改进Y26℃±l48h±2hCIN-1Y琼脂平板上为无色透亮、不粘稠的菌落。改进克氏双糖试验3个～5个，接种改进克氏双糖斜面，于26℃±l24h，将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。尿素酶试验和动力观看将改进克氏双糖上的可疑培育物接种到尿素培育基上，留意接种量要大，挑取一接种环，26l2h～4h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于26℃±l℃和36℃±l24h26℃有动力的可疑菌落接种养分琼脂平板，进展革兰氏染色和生化试验。革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(0.8µm～3.0µm)×0.8µm。生化鉴定常规生化鉴定：从养分琼脂平板上挑取单个菌落做生化试验，全部的生化反响皆在工程小肠结肠炎中间型耶尔弗氏耶尔森克氏耶尔森假结核耶尔鼠疫耶尔森注：+阳性；-阴性；d有不同生化型。26℃工程小肠结肠炎中间型耶尔弗氏耶尔森克氏耶尔森假结核耶尔鼠疫耶尔森注：+阳性；-阴性；d有不同生化型。耶尔森氏菌森氏菌氏菌氏菌森氏菌氏菌动力(26℃)+++++-尿素酶+++++-VP试验(26℃)+++---鸟氨酸脱羧酶++++--蔗糖d++---棉子糖-+---d山梨醇++++--甘露醇++++++鼠李糖-++--+生化鉴定系统可选择使用两种生化鉴定系统(APl20E或VITEKGNI+)API20E：从养分琼脂平板上挑取单个菌落，依据API20E操作手册进展并判读结果。VITEK全自动细菌生化：从养分琼脂平板上挑取单个菌落，依据VITEKGNI+操作手册进展并判定结果。血清型鉴定除进展生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。具体操作方法按GB／T4789.40因子血清分型。结果报告25g(25mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。附录A(标准性附录)培育基和试剂改进磷酸盐缓冲液成分磷酸氢二钠8.23g磷酸二氢钠1.2g氯化钠 5.0g三号胆盐 1.5g山梨醇 20g制法将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再参与三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH为7.6，分12115min，备用。CIN-1培育基根底培育基：胰胨20.0g酵母浸膏2.0g甘露醇20.0g氯化钠1.0g去氧胆酸钠2.0g硫酸镁0.01g琼脂l2.0g蒸馏水950mLpH7.5±0.112115min，备用。Irgasan：以95％的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成0.4％的溶液，待根底培育基冷至801mL混匀。50℃时，参与：中性红(3mg／mL) 10.0mL结晶紫(0.1mg／mL) 10.0mL头孢菌素(1.5mg／mL) 10.0mL生霉素(0.25mg／mL)10.0mL最终不断搅拌参与l0.0mL10％氯化锶，倾注平皿。改进Y培育基成分蛋白胨 15.0g氯化钠 5.0g乳糖 l0.0g草酸钠 2.0g去氧胆酸钠6.0g三号胆盐5.0g丙酮酸钠2.0g孟加拉红40mg水解酪蛋白5.0g琼脂17g蒸馏水1000ml.制法将上述成分混合，校正pH7.4±0.1。于121℃高压灭菌15min，待冷至45℃左右时，倾注平皿。改进克氏双糖培育基成分蛋白胨 20g牛肉膏 3g酵母膏 3g山梨醇 20g葡萄糖 1g氯化钠 5g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂 12g酚红 0.025g蒸馏水 1000mlpH7.4制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。参与0.o2％的酚ETJ(溶液l2.5mLl21℃高压灭菌15rain，放置高层斜面备用。糖发酵管成分牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化钠 3g磷酸氢二钠 2g0.2％溴麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mLpH7.4制法葡萄糖发酵管按上述成安排好后，按0.5％参与葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，12115min。l00mL，12115min。另10％溶液，同时高压灭菌。将5mL100mL培育基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应承受过滤法除菌。试验方法从琼脂斜面上挑取少量培育物接种于26℃±l2d～3d14d～30d。鸟氨酸脱羧酶试验培育基成分蛋白胨 5g酵母浸膏 3g葡萄糖 1g蒸馏水 1000mL1.6％溴甲酚紫-1mLL-鸟氨酸或DL-0.5g／100mL1g／100mLpH6.8制法l00mLL-鸟氨酸按0.5％参与，DL-1％加人。再校正pH6.8。比照培育基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，ll510min。试验方法26℃±l18h～24h，观看结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者由于产碱，培育基呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培育基变为黄色。比照管为黄色。半固体琼脂成分蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂 0.35g～0.4g蒸馏水100mLpH7.4制法pH。分装小试管，121℃高压灭菌15min，直立凝固备用。注：供动力观看、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V—P试验用)成分磷酸氢二钾 5g多胨 7g葡萄糖 5g蒸馏水 1000mLpH7.0制法溶化后校正pH1mL，12115min。甲基红(MR)试验26℃±l2d～5d，哈夫尼亚菌则应在22℃～25℃培育。滴加甲基红试剂一滴，马上观看结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：l0mg30mL9520mL蒸馏水。V-P试验26℃±l2d～4d22℃～25℃培育。参与％萘酚乙醇溶液0.5mL和40％氢氧化钾溶液0.2m，充分振摇试管，观看结36℃土l4h再进展观看。碱处理液0.5％氯化钠溶液氯化钠 0.5g蒸馏水 100mL0.5％氢氧化钾溶液氢氧化钾0.5g蒸馏水 100mL制法0.50.5％氢氧