动物与家蚕的转基因技术

动物与家蚕的转基因技术第一页，共四十九页，编辑于2023年，星期五转基因技术第二页，共四十九页，编辑于2023年，星期五

转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgenetechnology）。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Geneticallymodifiedorganism，简称GMO）。第三页，共四十九页，编辑于2023年，星期五

GeneticallyModified——转基因，简称GM。是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。

第四页，共四十九页，编辑于2023年，星期五

转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可能育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，转基因超级鼠比普通老鼠大约一倍。生产的肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性，已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果。

转基因动物第五页，共四十九页，编辑于2023年，星期五1.转基因绵羊第六页，共四十九页，编辑于2023年，星期五2.转基因鲤鱼第七页，共四十九页，编辑于2023年，星期五1．转基因动物的发展1980年，J.W.Gordon等人首次报道用显微注射的方法向小鼠胚胎注射纯化的DNA，开辟了转基因动物研究的先河。1982年，R.D.Palmiter等又报道用转移生长激素基因的方法，获得了7只转基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被称为巨鼠，引起极大的轰动。相继有转基因猪、鱼、兔和羊等问世。第八页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第九页，共四十九页，编辑于2023年，星期五国外转基因动物首创记录

年份研究者基因/转入方法转入动物结果1980GordonHSV-TK小鼠78只子鼠中有2只为转基因鼠1981Constantini兔珠蛋白基因小鼠24只子鼠中9只为转基因鼠1982Palmiter将MT启动子和大鼠GH基因接成的融合基因侏儒小鼠7只转基因中1只生长加快，明显增大1985Wagner拼接有NEO基因的逆转录病毒小鼠获得整合体小鼠1985Hammer制备转基因兔、羊、猪均获得成功1986RobertsonMPSA-mos-Neo逆转录病毒感染ES细胞得到可遗传的转基因动物1987Thomas利用ES细胞法结合同源重组技术小鼠制备出Hprt基因定点突变的转基因小鼠1988Biery牛转基因牛成功1990Hochi大鼠转基因大鼠成功1994Love线性质粒鸡7只鸡活到性成熟，1只公鸡给后代传递外源基因1994Ono基因微注射鹌鹑有46.6%胚体表达了外源基因1998Wilmut绵羊乳腺细胞绵羊体细胞核克隆，获得绵羊“多利”第十页，共四十九页，编辑于2023年，星期五年份单位及研究者基因/转入方法转入动物结果1984发育所陆德裕等人珠蛋白小鼠个体大，基因可连续传递，但表型似不能保持1986发育所史瀛仙等牛及人生长激素小鼠DNA能转录成RNA的小鼠体型大，未能转录成RNA的小鼠体积小，说明基因在体内一定要转录成RNA，并翻译成蛋白质，才能起促进生长的作用。1987发育所于建康等大肠杆菌galk基因小鼠产21只，2只DNA中含有大肠杆菌galk基因1995北京农大陈永福等ZPL线性化的DNA导入猪受精卵猪获转基因猪，为避免猪过早死亡，采用传代、后诱导表达法1996中国农科院畜牧所黄少华等微注射SMT-PGH基因到猪早期胚胎猪妊娠率随移入胚胎数的增多而提高，以20-30为宜1997江苏农科院范必勤等用体外获能的精子为载体，通过体外受精导入基因猪建立新的基因导入方法1998上海医学遗传研究所曾溢滔等人凝血因子山羊产出5只转基因羊，其中1只母羊乳汁中含有人凝血因子1999上海医学遗传研究所曾溢滔等人血清蛋白奶牛移植8头牛，妊娠3头，生产1头公牛，携带有人血清蛋白基因国内转基因动物首创记录

第十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期五⑴经典的技术路线

先从已交配的供体动物的输卵管中采取受精卵；显微注射法向受精卵的雄性核导入人工构建的药物蛋白基因；经外科手术把已导入外源基因的受精卵移入同步发情的受体母羊输卵管内；让受精卵在“养母”体发育至分娩出生；用分子生物学技术检测出生小羊是否已整合了导入的外源基因。该法的缺点：实验周期长，注射的外源基因整合率低。3.转基因动物的技术路线第十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期五⑵整合胚胎移植技术路线

该技术是对前种方法的改进。它利用了生殖技术中的体外受精技术，使精子和卵子在体外受精；然后找到一个最佳时机向体外受精的细胞显微注射药物蛋白基因。然后在体外对胚胎体进行整合的鉴定。从中挑选有目的基因整合的胚胎进行移植。采用经阴道的非手术胚胎移植法，减少了对受精卵的损伤。第十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期五⑶核移植（克隆）技术路线

利用克隆技术进行转基因实验。即在进行克隆之前，先目的基因注射到将进行移植的核中，在按克隆技术进行操作。其成功率比经典技术路线高2.5倍。⑷整合卵受精技术路线

即在受精之前先将药物蛋白基因注射进入卵细胞，经检测已经完成整合后，再进行体外受精和胚胎移植。第十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期五

A.互补DNA(cDNA)的克隆

通过提取组织中的mRNA,用反转录酶合成cDNA，建立cDNA文库，再克隆目标蛋白的cDNA。由于cDNA缺乏内含子，影响基因导入后的表达效率。

B.DNA克隆

首先建立动物的DNA文库，再通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常用的方法。目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使DNA达到一定浓度就可用于基因导入受体。目前获得目标基因的途径有两种方法：第十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期五基因导入的方法

A.反转录病毒感染法(retrovirusinfection)B.显微注射法(microinjection)C.胚胎干细胞法(EScelltransfermethod)D.精子载体法(Sperm-mediatedgenetransfer)E.生殖细胞转染法(Germcelltransfected)F.细胞核移植法(Cellnucleartransfer)第十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期五A.反转录病毒感染法

反转录病毒是双链RNＡ病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。在利用病毒载体转基因时，首先要对病毒基因组进行改造，将外基因插入到病毒基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。

优点:方法简单，效率高，外源DNA在整合时不发生重排，单位点、单拷贝整合，并且不受胚胎发育阶段的限制。缺点:携带外源基因的长度不超过15kb，载体病毒基因有潜在致病性，威胁受体动物的健康安全。第十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第二十页，共四十九页，编辑于2023年，星期五B.显微注射法(microinjection)

第二十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第二十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期五C.胚胎干细胞法

这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚腔中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。优点:对阳性细胞进行选择，实现外源DNA的定点整合。缺点:第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。第二十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第二十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期五D.精子载体法

它是利用哺乳动物的精子能结合外源DNA的特性，通过受精过程把外源DNA导入受精卵，获得转基因动物。优点:方法简单，转基因效率高。缺点:效果不稳定，外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。第二十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第二十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期五E.生殖细胞转染法

第二十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期五F.细胞核移植法

这种方法是随着哺乳动物体细胞核移植技术的发展而建立的。首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行传染，然后选择阳性细胞作核供体，通过细胞核移植，获得基因动物。这种方法是非常理想的转基因手段，因为它可与基因靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源DNA随机整合带来的负作用。这种方法的转基因效率可达100%，大大降低转基因家畜的生产成本。第二十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第二十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期五检测的方法A.外源基因的整合检测它是检测动物基因组中是否携带外源DNA。常用的方法是用目标基因的一段序列作引物，PCR仪扩增目标DNA，再通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用Southern杂交检测PCR阳性个体是否含有目标基因，如果出现阳性，就可断定为转基因阳性动物。B.外源基因的转录检测它是用Northern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。C.外源基因的表达检测它是检测转基因动物组织中是否含有目标基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。第三十页，共四十九页，编辑于2023年，星期五第三十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期五转基因动物的应用

在医学上

A.制备动物疾病模型与疾病相关的基因被克隆后,通过转基因技术制备动物疾病模型,可用来研究疾病的发生、发展规律和治疗药物的筛选,以此确定确定此疾病的最佳治疗方案。目前，在世界范围内发现人类的遗传疾病有3500多种,已建立约15种转基因疾病模型，其中包括糖尿病、高血脂症、β－地中海或镰刀型贫血症，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sDisease),动脉粥样硬化症等常见的疾病。第三十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期五B.用以研究癌基因的活动规律和肿瘤的发生机理。如SV40的启动子与胰岛素或晶状体蛋白基因重组后,制备的转基因动物出现胰腺瘤或晶状体瘤,进一步研究发现SV40启动子的72个核苷酸与肿瘤的发生有密切关系,已建立乳腺癌和前列腺癌的小鼠。C.用以治疗遗传疾病随着人类基因组计划的完成和基因定点整合技术的成熟，转基因技术有可能治愈人类的遗传疾病。D.生产人的代用器官用表达病人补体调节蛋白基因或敲除细管内皮细胞表面抗原决定簇基因猪的器官可替代人的患病器官,延长病人的寿命。第三十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期五家蚕篇第三十四页，共四十九页，编辑于2023年，星期五转基因家蚕所用载体

转基因载体是一类装载有外源DNA并使其随自身复制而得到扩增的DNA构造,并且具有可以将所携带的外源基因在一定条件下插入到宿主基因组中的功能,转基因载体包括一些固有的元件,如启动子、转座序列等,进行家蚕转基因操作,除了应注意目的基因的导入方法和导入时期外,选择合适的启动子和构建合适类型的载体也是技术的关键。第三十五页，共四十九页，编辑于2023年，星期五

转基因家蚕载体中所用启动子选择合适的启动子也是成功表达外源基因的关键因素之一,启动子是位于一个基因上游的一段DNA序列,它含有蛋白质(转录因子和RNA聚合酶)的结合位点,目前家蚕转基因多采用家蚕体内广泛存在的肌动蛋白A3启动子和多角体病毒极早期蛋白E1启动子。第三十六页，共四十九页，编辑于2023年，星期五基于转座子的载体目前应用于转基因家蚕研究最多的是piggyBac转座子,它也是昆虫生殖系转化使用最广泛的转座子,piggyBac转座系统常作为家蚕转基因研究采用的有效载体,第三十七页，共四十九页，编辑于2023年，星期五piggyBac转座子的结构第三十八页，共四十九页，编辑于2023年，星期五基于病毒的载体:

用于家蚕基因工程的杆状病毒主要有家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV),既可用于家蚕的种系转移,又可用于瞬时表达,

该方法是将外源基因插入到杆状病毒特定位点,得到重组病毒,通过重组病毒与家蚕基因组之间的同源重组将外源基因整合到家蚕基因组。第三十九页，共四十九页，编辑于2023年，星期五基因打靶载体

基因打靶技术以同源重组为基础,通过同源重组将外源基因定向地融合进靶细胞基因组中的某个位点,自20世纪80年代后兴起,人为地对某一预先确定的靶位点进行定点突变,可以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。与piggyBac转座子相比,其突出的优点是克服了随机整合的盲目性和危险性,因此是一种理想的修饰和改造生物遗传物质的方法。第四十页，共四十九页，编辑于2023年，星期五关于家蚕-基因导入的方法

A.反转录病毒感染法(retrovirusinfection)B.显微注射法(microinjection)C.胚胎干细胞法(EScelltransfermethod)D.精子载体法(Sperm-mediatedgenetransfer)E.生殖细胞转染法(Germcelltransfected)F.细胞核移植法(Cellnucleartransfer)第四十一页，共四十九页，编辑于2023年，星期五转基因家蚕的应用研究

研究基因功能:

在家蚕的全基因组框架图完成之后,目前的主要工作是对家蚕基因组计划所获得的大量基因进行研究,以探索其具体的生物学功能,由于转基因技术可以实现家蚕功能基因的过量表达或者基因功能的缺失,因此将成为研究家蚕基因功能的重要方法之一。要最终鉴定基因功能,最理想的方法是将分离的基因导入家蚕体内,在个体水平上验证其是否具有功能,特别是对于功能基因组学研究来说,不仅要确定序列的编码区和非编码区,还要鉴定相关的生物功能,因此只有转基因方法才能最终使我们认识所有不同序列的功能特征,转基因家蚕有助于研究家蚕系统发育调控以及基因群的相互作用。第四十二页，共四十九页，编辑于2023年，星期五研究基因的表达机制:

将家蚕基因的启动子或增强子序列和lacZ融合基因做成转基因家蚕,通过调查lacZ基因的表达,研究基因的表达机制。不同的蚕品种,其内部生理环境各不相同,生化代谢与调控也存在一定的差异,因此以不同品种的家蚕为对象进行转基因研究,所获得的转基因蚕中外源基因的表达水平有可能存在差异,通过转基因技术可以寻找易于表达外源基因的家蚕品种,从而为转基因家蚕的进一步应用提供参考。第四十三页，共四十九页，编辑于2023年，星期五改善蚕丝品质:

家蚕丝是一类性能优良的天然蛋白纤维,但却在抗皱性、耐磨性、固色性、涤特性等方面存在不足,而天蚕丝和蜘蛛丝的许多性能均优于家蚕丝,蜘蛛太具攻击性而不能饲养。所以许多研究人员一直致力于使用基因工程方法构建转基因家蚕用以突破传统育种的限制,通过人工构建蜘蛛丝、天蚕丝等蛋白的基因,并将其导入家蚕中,获得具有优良丝质性状的家蚕新品种一直以来都是研究的热点。第四十四页