动物细胞培养和核移植技术

动物细胞培养和核移植技术第一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五多莉克隆猴第二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五单克隆抗体等

动物细胞工程常用的技术动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合是其他动物细胞工程技术的基础。第三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五动物细胞培养和核移植技术第四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五一、动物细胞培养1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。第五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.一、动物细胞培养1、概念第六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织培养基有什么特别的地方？为什么选用动物胚胎或幼龄动物个体的器官或组织做动物细胞培养的材料？为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？为什么选用胰蛋白酶做上述处理？培养的细胞为何贴壁生长？什么是原代培养和传代培养？动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成为生物个体？2、动物细胞培养的过程（阅读思考）

第七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础第八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五2、动物细胞培养过程胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液10代细胞50细胞剪碎胰蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。比老龄动物的组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越容易培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖缓慢，核型可能变化动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型传代培养第九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五2、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变（分解弹性纤维）第十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五有关概念原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。通常把第1代至第10代以内的培养细胞称为原代细胞培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。第十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五有关概念

细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。第十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五细胞贴壁表面光滑、无毒，易于贴壁。5%CO2。维持培养液的pH第十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五2、动物细胞培养过程归纳动物组织分散成

单个细胞细胞悬液培养（原代传代

培养培养）胰蛋白酶胶原蛋白酶胰蛋白酶胶原蛋白酶原理：结果：细胞增殖（有丝分裂）细胞群，细胞产物第十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3、培养条件无菌、无毒消毒、灭菌抗生素定期更换培养液，清除代谢废物营养合成培养基：糖、氨基酸、生长因子、无机盐、微量元素（血清、血浆）温度和pH36.5±0.5℃，7.2---7.4气体95%空气，5%CO2?第十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.动物细胞培养的条件1）.无菌无毒的环境2）.营养3）.温度和pH4）.气体环境

第十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五大规模的生产有重要价值的生物制品病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体为基因工程技术提供受体细胞培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植有毒物质的检测，细胞的生理、药理、病理研究用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供依据动物细胞培养技术的应用第十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五4.动物细胞培养技术的应用蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植细胞的生理、药理、病理研究

第十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五植物细胞和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的分散处理脱分化细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株细胞群（细胞株、细胞系）无有有无第十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五思考：1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等成块组织不利于细胞生长和增殖，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体第二十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、概念动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易第二十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五2.体细胞核移植的过程：请看教材P48图2-21思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。第二十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆羊多莉黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利第二十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第二十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆步骤上第二十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五克隆步骤下第二十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五阅读与思考以概念图的形式表示体细胞核移植过程？取供体细胞取卵母细胞

供体细胞培养培养到MⅡ中期

卵母细胞去核

供体细胞注入去核的卵母细胞

供体核进入受体卵母细胞

重组胚胎

代孕母牛

生出与供体遗传物质基本相同的个体第二十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五思考题1、在进行体细胞核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？卵母细胞的细胞质可使体细胞核的全能性得以表达；卵母细胞体积比较大，容易操作；卵母细胞的细胞质多，营养丰富，能为早期胚胎的形成提供营养。2、为什么选卵母细胞作核移植的受体细胞？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的体细胞。第二十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五3.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未突变.思考题二倍体的核型：是指染色体组在有丝分裂中期的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和第二十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五思考题4.细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞.第三十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五体细胞核移植技术的应用前景1）、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程2）、保护濒危物种3）、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植4）、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病3、第三十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五1、成功率比较低

2、大多存在健康问题

3、克隆动物食品安全问题体细胞核移植技术存在的问题4、第三十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五胚胎移植技术胚胎移植的基本程序如下（以牛胚胎移植为例）第三十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五动物细胞融合与单克隆抗体第三十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五一、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合

受精作用第三十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五动物细胞融合第三十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒第三十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核第三十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。

思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？第三十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五二、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。第四十页，共五十五页，编辑于2023年，星期五B淋巴细胞与抗体

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。第四十一页，共五十五页，编辑于2023年，星期五单克隆抗体

由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：

特异性强、灵敏度高

第四十二页，共五十五页，编辑于2023年，星期五如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞第四十三页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体第四十四页，共五十五页，编辑于2023年，星期五第四十五页，共五十五页，编辑于2023年，星期五思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体第四十六页，共五十五页，编辑于2023年，星期五单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤

资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。第四十七页，共五十五页，编辑于2023年，星期五植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体第四十八页，共五十五页，编辑于2023年，星期五小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势第四十九页，共五十五页，编辑于2023年，星期五

下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是__________3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50B体外培养骨髓瘤细胞