双氢青蒿素对人喉癌细胞HeP

双氢青蒿素对人喉癌细胞HeP【摘要】目的：双氢青蒿素作用于人喉癌细胞，观察药物对其生长抑制作用.方法：采用细胞计数法、MTT法、软琼脂克隆形成试验等观察、测定双氢青蒿素对喉癌细胞的细胞增殖率、细胞群体倍增时间、双氢青蒿素对HeP2细胞生长抑制作用的剂量－效应曲线、时间－效应曲线以及对该细胞克隆形成率的影响.结果：①细胞生长曲线显示该细胞增殖活跃，生长稳定，细胞群体倍增时间为247h；②双氢青蒿素对Hep2细胞有明显的生长抑制作用,其作用特点呈浓度依赖性，其IC50值为446684μg/L.时间－效应曲线显示：当作用时间在24~120h时，呈剂量依赖性关系及时间依赖性关系.③双氢青蒿素药物浓度分别为320、1000、3200、10000μg/L时，克隆形成率分别为1150、09、06和05.结论：双氢青蒿素对HeP2细胞增殖及其生长有显着的抑制作用，随着药物作用时间的延长，对于细胞的生长抑制作用逐渐增强，表明双氢青蒿素在喉癌的化学治疗中对肿瘤细胞有直接的细胞毒作用.

【关键词】肿瘤；细胞；青蒿素；喉肿瘤

0引言

肿瘤的形成是一个多因素、多阶段、长期作用的过程，恶性肿瘤的形成是细胞生长与增殖的调控发生严重紊乱且复杂的过程.有资料表明，青蒿素及其衍生物对鼠艾氏腹水瘤细胞和人Hela细胞有细胞毒活性.用青蒿琥酯处理的HepG细胞可见梯状DNA和凋亡小体［1］.本实验将双氢青蒿素作用于HeP2细胞，观察对其生长抑制作用，旨在探讨抗肿瘤侵袭及肿瘤治疗方面为临床用药的筛选奠定一定实验基础.

1材料和方法

11细胞来源HeP2细胞系由第四军医大学秦都口腔医学院口腔生物学教研室提供.细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，体积分数为50mL/LCO2，37℃，饱和湿度条件下常规培养.

12主要实验仪器、试剂双氢青蒿素纯品由北京科泰新技术公司方辉药业有限公司提供,生理盐水稀释；MTT为Sigma公司产品；RPMI1640培养液、胰蛋白酶为Gibco产品.

13细胞增殖率测定取对数生长期HeP2细胞，常规消化后接种于24孔培养板，接种浓度为1×107个/L，计数法测定细胞增殖情况，实验重复3次,取平均值作图并计算细胞群体倍增时间.细胞群体倍增时间计算公式:DT(h)=t×lg2/(LgNt-lgNo)t代表细胞处于对数生长期的培养时间，No及Nt分别代表对数生长期的起始和终止的细胞数.

14双氢青蒿素对HeP2细胞生长抑制作用的剂量－效应曲线取对数生长期细胞，常规消化后以1×106个/L浓度接种于96孔培养板，24h后细胞贴壁.加入浓度为100～32000μg/L的6个浓度的双氢青蒿素，对照组加入不含药物的等体积RPMI1640培养液，每组分别设5个平行孔.常规培养5d，MTT比色法测定每组A490nm值.实验重复3次，取均值作图.以药物剂量的对数为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制剂量－效应曲线、时间效应曲线计算IC50值.

15双氢青蒿素对HeP2细胞生长抑制作用的时间－效应曲线接种细胞与实验加药分组同14.分别于药物作用1、2、3、4、5d后，MTT比色法测定每组A490nm值.实验重复3次，取均值，绘制时间－效应曲线并计算IC50值.

16软琼脂克隆形成试验采用双层琼脂培养法在24孔板中进行，底层含5mL/L琼脂，每孔1mL，4℃凝固.对照组加入等体积RPMI1640培养液.每组分别设4个平行孔.实验组双氢青蒿素药物浓度分别为320、1000、3200、10000、32000μg/L.常规培养2wk.倒置显微镜下计数每孔克隆数，计算克隆形成率，实验重复3次.按公式计算克隆形成率×100％.

17数据处理与分析细胞生长存活率=实验组光吸收值÷对照组光吸收值×100%.IC50定义为使实验组光吸收值下降至对照组的50%时的药物浓度，应用MicrosoftEXCEL软件绘制剂量－效应曲线，作图法计算双氢青蒿素对Hep2细胞的IC50值.

2结果

21HeP2细胞生长曲线细胞生长曲线显示该细胞增殖活跃，生长稳定，细胞群体倍增时间为247h，表明该细胞适合在观察生长变化的实验中应用.

22双氢青蒿素对Hep2细胞生长抑制作用双氢青蒿素作用于Hep2细胞,在小剂量情况下对细胞杀伤作用较轻,随着药物浓度的增加，细胞生长明显抑制，其作用特点表现为明显的浓度依赖性，IC50值为446684μg/L.双氢青蒿素对Hep2细胞药物剂量－效应曲线见Fig2.双氢青蒿素作用于Hep2细胞的时间效应关系如Fig3所示,药物各浓度作用组在作用12h内，对细胞生长无明显抑制作用，当作用时间在24~120h时，表现出剂量依赖性关系及时间依赖性关系.

23双氢青蒿素作用Hep2细胞克隆形成率检测双氢青蒿素作用于Hep2细胞可显着降低其克隆形成率.试验可见实验组细胞克隆形成逐渐减少，对照组及各浓度组克隆形成数及克隆形成率见Tab1.从克隆形态观察，对照组克隆体积大且呈球状，实验组克隆体积小，形态不规则.表1双氢青蒿素作用HeP2细胞克隆数及克隆率

3讨论

肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖与死亡比例,防治肿瘤是降低恶性肿瘤死亡率的重要途径之一,有关肿瘤治疗研究成为国际上关注的课题.目前从肿瘤的分子发生上讲，肿瘤的发生与癌基因的激活、抑癌基因的抑制调节基因和DNA修复基因的异常等细胞增殖分化以及死亡平衡失调等多种因素有关.恶性肿瘤形成的基本模式致瘤因素引起基因损伤，即获得原癌基因和/或灭活肿瘤抑制基因，可能还累及凋亡基因和/或DNA修复基因，使细胞出现多克隆性增殖，在进一步基因损伤基础上，发展成为克隆性增殖，形成具有不同生物学特性的亚克隆，获得浸润和转移的能力.

青蒿素是从菊科艾属黄花蒿(artemisiaannua)茎叶中提取的一种含过氧基团的倍半萜内酯.双氢青蒿素是我国自行研制的抗疟新药，是青蒿素的一个重要衍生物，由青蒿素经四氢硼钠还原而成［2］.双氢青蒿素具有吸收良好、分布广、排泄和代谢迅速、高效、低毒等优点,其口服生物利用度是青蒿素的10倍以上,抗疟作用是青蒿素的4～8倍［3，4］.近年来，青蒿素类药物的应用日益广泛，在抗肿瘤领域的应用更为引人注目.对不同组织中培养肿瘤细胞进行检测发现,双氢青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感,而对非小细胞肺癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌和肾癌细胞株的活性较低［5］.国内外对青蒿素类药物抗肿瘤研究相对集中于白血病、腹水瘤、乳腺癌、肝癌等，在喉癌细胞方面报道较少［6］.

喉癌是常见的恶性肿瘤，以磷状细胞癌为多见，目前大多数治疗方法为手术切除后行放疗化疗.本实验将双氢青蒿素作用于喉癌细胞，实验结果表明该药物对HeP2增殖及其生长有显着的抑制作用，其作用呈明显的剂量依赖性；同时，随着药物作用时间的延长，对于细胞的生长抑制作用逐渐增强，表明双氢青蒿素在喉癌的化学治疗中对肿瘤细胞有直接的细胞毒作用.研究表明，青蒿素化学结构中含有具有抗癌活性的α次甲基内酯环结构的萜类化合物，青蒿素的抗肿瘤作用可能与其作用于转铁蛋白影响细胞铁代谢从而抑制其DNA合成达到抑制细胞生长有关［7］，其具体的药理作用与机制尚待进一步研究.

【参考文献】

［1］陈沛泉，简华香，符林春，等.双氢青蒿素和奎宁对恶性疟原虫期配子体作用的随机比较［Ｊ］.广州中医药大学学报,2001;18(1):22.

ChenPQ,JianHX,FuLC,etal.Pairofhydrogenartemisininandcomparingatrandomtomalignantplasmodiumsearlygametophytefunctionofquinine［J］.JGuangzhouUnivTradChinMed,2001;18(1):22.

［2］刘宁,杨腊虎,张正行,等.双氢青蒿素差向异构体转化的研究［Ｊ］.药物分析杂志,2002;22(4):303-306.

LiuN,YangLH,ZhangZX,etal.Studiesontheconversionofepimersofdihydroartemisinin［J］.MedAnalMag,2002;22(4):303-306.

［3］李国栋，周全，赵文长，等.青蒿素类药物的研究现状［J］.中国药学杂志,1998;33(7):385.

LiGD,ZhouQ,ZhaoWC,etal.Researchcurrentsituationofthemedicine［J］.ChinaPharmMag,1998;33(7):385.

［4］宋振玉.双氢青蒿素在人的药代动力学及与青蒿素的比较［Ｊ］.药学学报,1993；28(5):342.

SongZY.Pairsofhydrogenartemisininmedicineinpeopletaketheplaceofdynamicsandcomparisonofartemisinin［J］.MedJ,1993;28(5):342.

［5］ChenPQ,YuanJ,DuQY,etal.EffectsofdihydroartemisininonfinestructureofsrythrocyticstagesofplasmodiumbergheiANKAstrain［J］.ActaPharmacolSin,2000;21(3):234.

［6］WangHZ,YangBF,LuoDL,etal.Theresearchofartemisininantiarrythmicac