第二章免疫组织化学的基本理论与技术

第二章免疫组织化学

的基本理论与技术一、免疫组织化学的基本理论1原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。2免疫组织化学全过程包括:

⑴抗原提取⑵抗体制备(博士德,华美,基因公司等购买)⑶抗体标记⑷免疫染色⑸观察分析等过程

二、抗原与抗体

1.抗原

Ag定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。

蛋白质：免疫原性最强；

多糖：免疫原性次之；

脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

2.抗体

Ab

定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。

存在部位：主要存在于血清内。

分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，即IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。根据制备方法不同分为两种即单克隆抗体与多克隆抗体IgG的结构

IgG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。浆细胞AbAb浆细胞BBAgBB浆细胞浆细胞AbAb多克隆抗体制备原理：将纯化的抗原注射入动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。单克隆抗体Ag合成抗体

效应性B细胞(浆细胞)不能在体外生长瑞士Kohler英国Milstein

多发性骨髓瘤细胞多发性骨髓瘤细胞不能合成抗体

能在体外大量繁殖

BB浆细胞浆细胞脾多发性骨髓瘤细胞AbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAbAb一抗单克隆抗体多克隆抗体缺点:价格较高，容易出现假阴性反应。实质:是受同一种抗原刺激，由多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。优点:容易制备，价格便宜缺点:可能与多种特异性和非特异性的抗原决定簇反应，出现非特异性染色，影响结果的判定。实质:是受同一种抗原刺激，由单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。优点:特异性强，敏感性高，抗体产量高。首选三、免疫组织化学的基本技术

免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗原(或抗体)检测组织和细胞内的抗原，从而达到诊断或研究的目的。特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准确与细胞和组织标本制各的质量好坏有着密切关系。因此，组织和细胞标本的取材和制备至关重要。

1.组织标本制备（1）标本新鲜：一般在2h以内进行。（2）取材部位：取含待检抗原部位，还应取病灶与正常交界处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开坏死区。（3）避免挤压：剪刀、刀片的刃口要锋利。（4）取材大小：做石蜡切片的组织厚度不宜超过2mm，用作冰冻切片的以4mm为宜。（5）固定:化学固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。2．细胞标本制备

(1)印片法应用：活检标本、手术切除的标本。方法：将新鲜标本暴露病区,用载玻片轻压病区，脱落细胞粘附于载玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低温保存。优点：简便省时，细胞抗原保存较好。缺点：细胞分布不均、重叠,影响观察效果

(2)穿刺吸取涂片法

应用：实质器官的病变区。方法：①穿刺液较少时直接涂片,力求均匀。②穿刺液较多时，穿刺液滴入2毫升Hanks液内，离心，制成细胞悬液，吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。优点：细胞均匀。缺点：细胞易变形。

(3)体液沉淀涂片法

1)细胞数较多，取一滴直接涂片。2)细胞数较少时，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10min，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。

（4）体外培养细胞1)贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。2)悬浮生长的细胞：可用离心涂片机法制成涂片。（5）离心涂片机法制成2×105-6／ml细胞悬液,取50～100μl，加入涂片机内，1000r／min,2min，细胞即可均匀分布于载玻片上。（二希）免披疫组罩织化味学的群固定亦方法免疫食组织柄化学滥固定轨的原挤则：最好廊地保释存细茫胞和些组织退的形倦态结锯构和励最大蛇限度待地保废存抗济原的别免疫蓝活性榴。方法哀：一）介固定紫有物席理固看定，接如血偿涂片荒可采镇用空私气南快速趴干燥输、冻哥结干须燥等广；二）挥化学下固定1．浸辣入法辱：组织柿立即敌浸于蔑固定够液内,时间句在2～12极h之间婶。2．灌太注法鉴：插管怀由左畏心室怎插入织主动老脉,先用PB棕S冲洗榆血液,再以泵梨或吊抹瓶灌栽注固呢定液漂。在微灌注柜后30很mi双n内取券材,再置摄同一走固定卷液内宗浸入铜固定l～3h。可稿使固键定液到达匙全身帅各处网组织解。3．微妹波固冶定：微波腔处理愧后,温度附升高,分子娱运动汁加快,促进斥固定液向籍组织植内渗中透,短时啄间达嫂到固糊定效牌果。圣将标窝本放入5～10胞ml固定叠液内,置于灶炉中爱央,周边或放一扛烧杯盛40暖0纯水堆以吸裹收炉援内产予生的歪热量,选择微强档傻照射10～30趟s,照后晴固定赶液温秀度≤50抗℃。取淘出后,在相同巨固定醒液内鹊再固蹲定2～6h抢(室温)。（三妈）重缓要固耀定液(1贪)醛类沙固定喇剂:为双殊功能板交联搂剂,可使纳组织路间相腾互交铃联，珠将抗如原保厌存于画原位辅。特灰点是爹对组萌织的捎穿透垄性强幕，收宗缩性察小.是常烦用固打定剂狠。1)罗1珠0％中捐性缓星冲福熊尔马辟林：李该固夜定剂驴易使便组织枣硬化孟而致茄浸蜡搜困难萌，因筋此固朝定时站间不齐宜过愿长。2)蠢4％多姻聚甲弯醛磷遵酸缓溜冲液稼：适肺应性竞较广兄泛，班因较悲温和腿，适撇于组柱织标兄本的蒙较长悟时期埋的保辱存。3)Bo庆ui环n'览s液：欣对组钱织固罚定力冰强且虽较均粗匀。江比单兔独醛残类固顾定更苏适和岸免疫州组化厚染色龟，较赴常用伶，通杨常4℃下固灿定6～8h。4)Za身mb梁on麻i液：亦用于亩光、惊电镜笨免疫尘细胞转化学古观察弊。(2晶)非醛年类固煤定剂码：为非刷醛类巷双功撕能试剧剂，孕单独奏应用猜时，壳边缘忌固定骄效应黎较重轧，但态与戊钢二醛秧或多庙聚甲鱼醛混处合使坝用时轿，效悦果明按显好社转。仍较适歇用于骂多肽单类激章素的令组织挥固定匆。1)碳化泄二亚刘胺液:适用魂于含预多肽侄激素益组织顾的固练定。2)碳二洁亚酰甘胺一挖戊二愈醛液(E断CD绍—G液)：对姜酶等宿蛋白满质固哗定效盖果良维好，谷对细蔬胞内舱抗原捉定位摧，超叮微结颠构保济存好讽，是重培养闪细胞虏电镜荡免疫拌细胞斧化学携的良锐好固庸定剂芹，也摊常用无于多沙肽类运激素匀固定桶。3)Ze坝nk齿er摸’s液：慢因含食重金镜属，识固定验时间桶要短致，以2～4h为宜伴。染咽色前摘必须浸脱汞融。(3秒)丙酮嫁及醇瞒类固遵定剂重：其作急用是劲沉淀馋蛋白劲质和置糖，巨对组黑织穿怜透性庆很强猜，能却够较骗好地逮保存岗抗原饲的免霉疫活罢性。客但醇抵类对常低分后子蛋罗白、轧多肽满及胞猪浆蛋秘白质砖的保做存效腰果较糕差。底与冰汁醋酸诸、氯猎仿、笼甲醛坝等混盟合使双用，历效果蜘可明自显改叮善。1)丙酮及：常用象于冰锅冻切谈片及傲细胞迷涂片之的后侵固定恳。保岔存抗宅原性大较好须，穿偿透性钟及脱佣水性生较强遣。2)95悼%乙醇谊：用于瘦冰冻收切片息及细喝胞涂置片的锹后固逃定。壤效果停较差,和其抚他试鹿剂混邪合使烈用,染色乏较好刃。3)AA吹F液：较常辱用的渠固定课液。(9忌5～10埋0％乙伯醇85休ml，冰挎醋酸5m逆l，浓浆甲醛10剪m1贴)。4)Ca施rn宗oy液：10暗0％乙绳醇醇60饰ml，氯翻仿30丹ml，冰精醋酸10竖ml，混词合后4℃保存箩备用圈。3．固伍定剂催的选惰择固定伟剂的絮种类恶很多历，至刚今尚幅无统瓦一标是准的锡固定删剂，10％中降性甲奶醛是创国际书最通流用的你固定挽剂。幕需指职出，蹦同一您固定进液固渠定的颂组织臭，染趁色结虑果可营截然郊不同内；不素同的灵抗原船和不搭同的百组织驴标本熟往往煎需反伶复试蒜验，蛋必要投时可烘做多途种固强定液滚对比赚，才诊能选予出最悲佳的斥固定治液。抗原适用固定液细胞表面抗原100％丙酮，95％乙醇，10％福尔马林，Bouin液免疫球蛋白Zenker固定液，10％福尔马林，95％7,醇，100％丙酮酶，蛋白类10％福尔马林，Bouin液，95％乙醇，100％丙酮肽类激素Bouin液，10％福尔马林，95％乙醇，100％丙酮固醇类10％福尔马林，Bouin液补体95％乙醇，100％丙酮，10％福尔马林，Bouin液肿瘤胚胎抗原10％福尔马林(四)组织裙包埋济和切答片技喉术固定剃的和矿未经伟固定球的组裂织、挥细胞杨以及歼各种种涂片汉和切趋片方黄法均燥可用也于免卷疫组粱化，崭但其料效果某不同哥。光摘镜免载疫组哄织化缸学的叶切片升厚度赖一般践为4～6μ速m，而辱神经嫩组织若切片州通常叉为20～10埋0μ蔽m厚，旧以便涨显示届神经郊纤维宗的走捉行。1．冰丧冻切着片冰冻粪切片(f陕ro注ze捐n庭se败ct旦io靠n)是酶阴组织担化学夏和免闯疫组穴织化熔学染泻色中商最常赖用的每一种挨切片婚方法屑。优点蚕：1）能厉较好痰地保腔持抗竹原活起性(尤其或是表秀面抗原)和酶旅的活说性。2）冰毙冻切杨片简县便快命速，盛省去搁固定庭、包君埋和切造片处蔬理等当一系省列繁扣琐步权骤。适用矿范围靠：新鲜粪的组附织及表已固霉定的仙组织番均可佩作冰冻级切片饼。缺点庭：1）不职能用也于回根顾性乎研究抗。2）不饥利于强常规达检查皱和长专期保竟存标壶本。3）不壤如石伸蜡切柳片结猴构清默晰。（1）冷牲冻、滔包埋为防趣止冷度冻中唉形成浆冰晶恭破坏折组织搬结构部和保底持抗校原，化采取汗：1)浸入晶深低富温预恐冷的姓（干印冰容规器内票，-7宣0℃席)正已午烷液观内骤柜冷30～60秒，烘或用OC殃T包埋历剂浸敏透，棍使组缘瑞织速黎冻，久温度冲骤降淘，减浇少冰烫晶的勾形成曲。方牧法：钉①干欠冰-丙酮供法：溜②央液氮质法：2)将固僚定后姑或未驶固定猛的组芽织置俗于20％-3锤0％蔗餐糖溶涨液l～3天。圈利用渣高渗攻吸收兼中水篇份;减少宣组织贝含水舰量。搜包埋吃、冷角冻步畏骤同暴上。(2怀)切片技术属难度窝较大嫂，选踪蝶择好食的冰丹冻切答片机葱是保糟证切污片质丝式量的尾关键养。1)恒冷根箱切欣片机(c模ry形os勾ta岸t)肆—常用雁、理泽想的美切片锤机：切片恶机置抵于-3女0℃低温慈密闭识室内杜，可菊连续议切薄问片．胆切片尖时，怖低温鸽室内集温度挺以-1瓦5～-1爆8℃为宜封，温摆度过扩低组渗织易而破碎收。2)开放办式冰援冻切屯片机心：切虹片时垂暴露缝空气卫中，朗切片懒技术叫难度正大。凭在高哨温季大节，植切片姥更加块困难北，目章前处粪于淘足汰阶备段。(3等)冰冻匆切片清的保丈存使名用如不印染色愈，必互须室奶温下专吹干30尊mi鼓n以上肠，装名入密优封的联标本航盒内超，外抖包塑咽料袋天，置尾于-2旷0℃低温机冰箱训，一窜个月嫂内使撕用。染色窗前，汤从冰得箱内烘取出春切片遮，置辟室温驱干燥10按mi泄n，再业经丙致酮固页定5～10塑mi写n(未固臣定者)，即则可进禽入染娘色程初序。2.石蜡棚切片石蜡肢切片(p菊ar购af畜fi张nse溪cf帅io限n)：指颜在切肚片前应，固千定的兆组织薯块需继经乙羊醇逐揭级脱紫水，修二甲老苯透岁明，园再浸液蜡包截埋。组织里在浸点蜡、策包埋嫁时，戏石蜡间温度德应低夫于60巩℃，各榨步骤尊时间紫均不踩宜过璃长(1～2h拾)，以落免组雅织变头脆。切片胞一般减厚约3～5μ钞m，切牙片于37胃℃烘烤回过夜际，可挣置4℃保存闯，脱捷水、宇透明连也可右在4℃进行厅。（怎详见盼组织咸学与笨胚胎饭学第耀六版哲）3．振尤动切样片振动颈切片难是将爪新鲜密组织(不固周定不跟冷冻挡，或射低浓堆度固宗定液屈稍稍婶固定)后用率振动氧切片轮机切缎成20～10卡0μ霉m厚，辰漂浮弟免疫能组化筐染色怖，检案出阳法性部土位，捏后固乱定，斜常规失电镜乱样品惜制备桌。适舌于免认疫电聋镜细教胞化东学观跌察。4．披塑料棍包埋萄切片(p且la隙st傻ic观s恒ec搞ti畜on佩)常用侮的包套埋材紫料有谅两大吵类：化甲基私丙烯姨酸盐女类和嘴环氧据树脂业类。前者助能较片好地化保存盛抗原束，不以与组葬织产陶生共装聚合回，染缘瑞色前己不必收脱去币包埋竿材料捞，但柏形态己结构剂欠佳哪，切持片易射皱折面；后者俱能较热好地价保持双形态竭结构追，但林在聚忽合过慰程中闲易与虎组织午作用标，改资变抗纷原结春构。优点填：组略织块恩可同勉时用半于一袋般光山镜切暂片、劈燕半薄爽切片(0判.5～1.狱5μ放m)和电剃镜超当薄切它片。缺点因：所付经步胞骤繁之琐，犹抗原屿活性乖易丧岭失。应用轿范围拿：塑票料包于埋切遣片主颗要用貌于免莫疫电译镜超谎薄切砌片前盲定位滩。5.超薄爽切片超薄仔切片(ul浴tr罗at背hi音nse辽ct古io粘n)适用巷于免牧疫电局镜细煤胞化探学，印需用罢超薄蜘切片径机(详见颈有关跨电镜化技术救资料)。6．载肯玻片中及盖血玻片盾的处不理和密切片狠的附洁贴(1扇)载玻币片及呼盖玻薄片的研处理1)载玻宅片：呢清洗渠液(酸)浸泡12测-2蒙4h，水野洗，95％乙渐醇浸黎泡2h后擦旨干或挠烤干淡。2)盖玻抽片：推清洗废液浸朱泡2h，或尤盐酸熊乙醇忍浸泡态后水蹄洗，95％乙浩醇浸律泡，兄擦干偿。(2嘴)切片婶的附颗贴为防索止染丹色过喊程脱地片，篇适用俭免疫乞组化芒染色器中的酸附贴刊剂：1)甘油墙．明恩胶；2)甲醛望一明颂胶；3）铬民明矾-明胶失；4）多锯聚赖喇氨酸(P故ol南y-纲L-郊Ly症si众ne讨)；5）AP方ES；6）AP夏ES和Po卫ly翁-L粒-l卸ys帝in析e联合铺应用煤：适穴于特肃别容雪易脱睬片的先情况搅。（五）紧免疫曾组织拿化学肝的染损色方揭法及唤注意帖事项一）免疫捧组织买化学终染色浆方法1.按标福记物衡种类筝分为屯：免疫葱酶法离；免疫买金一快银法而；铁标贴记法滚；免疫即荧光熟法；双重领或多弯重免按疫染幸色法牢等。2.按标增记抗肝体不面同分拜为:（1）直漆接法尊：抗原+一抗惧（标记大物标记划）镜下捡观察优点：简单愧，时比间短屠，特延异性摸强。缺点俘：灵著敏度浊差，合所需屡抗体吗量大孔，不莲经济患，淘币汰。（2）禁间接傲法：经过耻二次咳抗体抗原+一抗+二抗陡（标县记物败标记讲）特点锻：较狐直接芦法灵图敏，守可标缺记一过种抗幕体→趋鉴定浊多种晌抗原阳。（3）非标虹记抗判体桥店法（六桥连洪法、此多步优法）经过豆三次晓抗体特点班：任何羞抗体税均未卷被酶提标记壁；酶是退与抗捎酶若抗体河结合坛，避六免因姨共价拾结合星对抗昨体和扫酶活狸性的培影响狐，提播高敏可感性居，节奸约一酱抗用描量。抗标劳记物跪抗体秤（用坛与一汇抗同罩种动曾物产尽生）抗标骂记物违抗体+标记镇物=免疫靠复合池物(如PA姓P，AP浴AA若P)尺,抗原+一抗+二抗+三抗短（PA区P，AP半AA塔P）1）单尊桥法抗原+一抗+二抗止（桥谎抗体道）+三抗磁（抗申酶抗似体）底物叼显色2）双桥付法在三意抗之木后，株将二跟抗和猪三抗引再重啦复一看次，鸭可增顶大染融色强尖度。★压特别颈提示糟：注架意动背物种梨属关韵系的键一致归性。（4）葡荐萄球辆菌A蛋白慰法（5）AB孩C法、SA彻BC、En盒vi朋si屋on输…2免疫呆组化珠染色闷基本腰技术（1）抗格体稀丛释度1）工骗作液--晶-2）血原液--抗-预实萍验3）拌抗体邀浓度意选择--笨--控制瘦一定旨浓度昆范围（2）抗邪体滴维片技哗术（3）PB贼S洗涤1）目院的--锈--统-保证露离子输浓度舱、PH、减驻少非杆特异抚反应2）方项法（3）抗屑体孵或育技驶术湿盒较、温雄度、衔时间二）肢免疫超组化汇染色负注意款事项窝：①pH：中性朋及弱舍碱性反应阿液和瘦洗涤炕液：pH若7皇.2或-7梢.4缓冲与液配交制②难离子乡丰浓度告：低离业子浓驰度：0.尖01厘-0挺.0岂2m广ol／L缓冲贿液③冬去污呆剂：0.爽05％Tw腰ee诱n2袭00.汇01%ED饲TA0.交1％-l％Tr鸟it辱onX-搂10尾0可分摧别加吵入反挠应液由和染退色前荡洗涤仁液内④葬抗体沫稀释推液中弟蛋白乐质浓去度：减少缸抗体国的非苗特异谅性吸胞附0.税1-秧0.各6％牛贿血清崇白蛋扇白(BS杨A)5-降10％正迅常山年羊血里清⑤冠防腐兔剂：Na页N3(0舌.0渠l％)-栽--抑制雨非特枯异性弟着色仔、提老高灵区敏性⑥忆温度阻和时与间：⑦眠湿度⑧杂洗涤衬：可除验去前筹一步没所加织的未杰结合妨抗原江或抗栋体，胸以消碰除因胡非特诞异性府染色脖。洗涤很液中渣可加辽入去环污剂振荡（六疏）对销照目的哗：证明肯和肯格定阳查性结虽果的棚特异鸡性。主要胳是针令对第酱一抗快体对行照，患常用懒的对疏照方储法包耳括：①垦阳性答对照纵；②错阴性童对照泪；③膜阻断糟试验画；④雷替代悦对照妄；⑤产空白酬对照绕；⑥剃自身眉对照顾；⑦壮吸收硬试验课。(一)阳性漠对照已知好抗原阳阳性舟的切哀片--门--衰-阳性锅对照待检柏标本舌呈阴厕性结拐果时判，阳纪性对丈照尤卷为重主要。(二)阴性给对照不含旱已知腥抗原答的标下本--辱--阴性秒对照空白亦、替留代、框吸收旅和抑寇制试蔽验都搬属阴述性对趋照待检跟标本哨呈阳聋性结割果时碑，阴辣性对惰照就识更加令重要莲，用撕以排阳除假封阳性室。准确真判断猴阳性气和阴初性,排除凤假阳耳性和闯假阴侍性结残果对照也实验多次纷重复硬实验几种维方法的进行琴验证（七贺）免旺疫细如胞化传学结垫果的苗判断特异丹性染叶色与环非特摊异性照染色价的鉴祝别点特异年性染辜色表默现：常分诸布于酿特定夹的部削位,即具趁有结店构性斧。在同斑一切斧片上社呈现清不同遗程度消的阳派性染说色结婆果。非特欺异性比染色么表现温：无一料定的抱分布冒规律,常为屋成片遗的均呀匀着席色；细胞药和周刊围的说结缔恋组织究均无习区别亚的着始色,或CT呈现过强染口；切片佛的边笛缘、央刀痕史、组间织折辩叠部存位易识出现正。非特室异性移和特慎异性岂染色闭同时宫存在衡：过强鞠的非弄特异嗽性染迎色背奶景1阳性欠细胞妄的染膨色特滨征(1)阳性拢细胞浓染色分布园为灶然性和放弥漫佛性，三种够类型玻：①羊胞浆田：大时部分滴抗原浊见于钓细胞仍浆②呼细胞吩核③真细胞际膜表诉面(2狐)细胞哥内含陷抗原这量不势同咱染固色强池度不冤一(3）阳纸性细丑胞与暂阴性围细胞西相互虑交杂做分布;(4性)相同政的阳迁性染屡色强卷度,不能叛用于覆判断宗阳性垒。如：什切片凳边缘屠、刀吵痕、养皱折军区；坏死拴或挤僚压的玩细胞荣区；结缔亏组织蜓等结拢束2）双桥宅法在三州抗之彩后，弦将二穗抗和路三抗紧再重亡复一马次，映可增熟大染认色强盾度。★见特别做提示俩：注斑意动他物种可属关消系的苹一致绍性。（4）PA率P法（什过氧鸣化物