细胞生物学课件第3章 细胞生物学研究方法abc

第三章细胞生物学研究方法要求：①、基本概念；②、基本原理；③、基本过程；④、技术应用

细胞生物学研究技术的主要分类：1．细胞形态的结构结构的观察方法2．细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术3．细胞培养与细胞工程4.细胞及其生物大分子的动态变化5.模式生物与功能基因组的研究第一节细胞形态结构和观察方法细胞的形态观察细胞的大小和计量单位鸵鸟卵=12-15cm人卵细胞=0.1mm多数细胞=10-30μm血细胞=7μm分辨率肉眼0.2mm光学显微镜0.2µm电子显微镜0.2nm扫描隧道显微镜样品制备技术显微镜观察范围&肉眼观察范围1.目镜2.准焦螺旋3.物镜4.载物台5.反光镜一、光学显微镜(lightmicroscope)（一）普通复式光学显微镜——组成（一）普通复式光学显微镜技术

目镜

光学放大系统物镜

光源1.组成

照明系统

折光镜

聚光镜

机械和支架系统（一）普通复式光学显微镜——成像放大的倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜进一步放大成虚像（一）普通复式光学显微镜——分辨率分辨率：显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2µm物镜参数石蜡切片H.E染色（一）普通复式光学显微镜——样品制备（二）相差显微镜和微分干涉显微镜利用光线干涉的原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞的观察A.当两束光的相位相同时，相互干涉的结果使光波的振幅增加B.当两束光的相位相反时，则导致光波的振幅降低体外培养MDCK细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加“环状光阑”和“相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差（二）相差显微镜和微分干涉显微镜微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别分辨率比普通光镜提高了一个数量级录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程（二）相差显微镜和微分干涉显微镜

(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy

(B)phase-contrastmicroscopy(C)Nomarski

differential-interference-contrastmicroscopy(D)dark-fieldmicroscopyFigure9-8MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)Fourtypesoflightmicroscopy荧光：分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出的可见光(波长比入射光长)（三）荧光显微镜——基本原理光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成（三）荧光显微镜——基本原理免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品，可同时显示不同成分在细胞中的定位（三）荧光显微镜——样品制备（三）荧光显微镜——应用在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结构成分（四）激光扫描共焦显微镜以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息，形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜1.4～1.7倍Figure9-20MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)（四）激光扫描共焦显微镜可通过“光学切片”叠加后重构出样品的三维结构荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜透射电镜

transmissionelectronmicroscope,TEM扫描电镜

scanningelectronmicroscope,SEM二、电子显微镜（一）透射电子显微镜电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录Figure9-42(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别2．电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数电子显微镜分辨率可达0.2nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率3．电子显微镜的基本构造电子束照明系统成像系统真空系统记录系统戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像（二）透射电镜制样技术——超薄切片技术Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)超薄切片技术显示的细胞超微结构应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构（二）透射电镜制样技术——负染色技术观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5nm左右（二）透射电镜制样技术——冷冻蚀刻技术包括冰冻断裂与蚀刻复型两步，观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感，样品不需固定包埋。

核孔复合物电镜三维重构与低温电镜技术电镜三维重构技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术（三）扫描电镜技术利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌Figure9-49(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)（三）扫描电镜技术样品利用CO2临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜一般扫描电镜的分辨本领仅为3nm注意样品制备技术的差异！小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png三、扫描隧道显微镜探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领可以在真空、大气、液体等多种条件下工作非破坏性测量第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带二、细胞成分的细胞化学显示方法显色剂与细胞组分中特殊基团的结合通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应Feulgenstain特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiff’sreagent）反应呈紫红色三、特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察（一）免疫荧光技术直接间接免疫荧光技术（A）间接免疫荧光技术（B）（二）免疫电镜技术在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置原位杂交技术光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合FISH(FluorescentInSituHybridization)五、定量细胞化学分析与细胞分选技术流式细胞术第三节细胞培养与细胞工程http:///The_Origin_of_Hela_Cells一、细胞培养——动物细胞培养分为原代细胞和传代细胞细胞系：有限细胞系和连续细胞系细胞株：基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养一、细胞培养——植物细胞培养单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，通过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株一、细胞培养——植物细胞培养原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株二、细胞工程（一）细胞融合与单克隆抗体技术细胞融合灭活的病毒化学物质（如PEG）电融合同核体（homokaryon）异核体（heterokaryon）合核体（synkaryon）单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体的制备（二）显微操作技术与动物的克隆细胞拆合：胞质体，核体物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等克隆羊多莉的培育第四节细胞及生物大分子的动态变化MartinDN,BaehreckeEHDevelopment2004;131:275-284一、荧光漂白恢复技术亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性，淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率fluorescencephotobleachingrecovery，FPRFigure10-36aMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)二、单分子技术与细胞生命活动的研究指在单分子水平上对生物分子的行为(构象变化、相互作用、相互识别等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵﹑调控等useopticaltrapstoprobethesteppingofsinglemoleculesofkinesinFluorescentimageofsinglemotorproteins(left):Motionoftwodiffusingkinesinmolecules(green)onamicrotubule(red)shownasatimeserieskymograph.Schematic(right):Bydraggingdiffusingkinesinmoleculeswithlasertweezersoveramicrotubule,thefrictionforcebetweenthemotoranditsmicrotubuletrackcanbemeasuredveryprecisely三、酵母双杂交技术在体内分析蛋白质－蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才具有完整转录激活功能的原理四、荧光共振能量转移技术（FRET技术）FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer)

荧光共振能量转移：是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移到受体激发态的过程,它是一种非辐射跃迁。发生FRET时，分子间距离小于10nm。如果发生FRET，则供体通路信号将淬灭而受体通路信号将激活或增强。因此我们可以利用这一研究方法，结合细胞活体实时观察系统和图象分析技术，可以研究两个蛋白质分子在细胞内的时间和空间上的相互作用。分子具有不同能级：分子中的外层电子，一般处于电子的基态S0(electronicgroundstate)的最低振动能级吸收光能以后，它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级。这－过程发生在10-15s时间内被激发的分子，首先释放能量回到S1的最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级，并以光子的形式释放能量，即发射荧光Howitworks?荧光共振能量转移技术(FRET)应用检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光两个蛋白未相互作用相互作用FRETtostudyprotein-proteininteraction?五、放射自显影技术利用放射性同位素的电离射线对乳胶(含AgBr

或

AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示根据实验要求选择合适的同位素研究DNA合成时通常用氚（3H）标记的3H-TdR研究RNA合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸五、放射自显影技术对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影胰岛B细胞电镜放射自显影结果3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内第五节模式生物与功能基因组的研究Figure1-44MolecularBiologyoftheCell,FifthEdition(©GarlandScience2008)一、细胞生物学研究常用的模式生物模式生物通常个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物Whydoweneedmodelsystems?AllcellsaredescendedfromacommonancestorSimplesystemstostudyabiologicalquestionExtrapolateresultstohigherorganismsAdvantageouscharacteristicsfoundinmodelorganismsAmenabletogeneticmanipulationReproducerapidlyTransparentDefinedcelllineage…（一）大肠杆菌原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易