免疫检验第十二章免疫组化

免疫检验第十二章免疫组化第一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五活体组织：组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织(经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细胞有重叠）各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹水等）。培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。第二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用,防止细胞自溶；固定细胞形态和结构②保持组织细胞的抗原性③防止细胞层脱落④去除细胞内的脂类（妨碍抗体结合）⑤防腐

不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合。固定时间：一般12小时内，不易超过24小时。第三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛等（根据抗原的耐受性选择）

缺点：抗原容易被掩盖，特别是甲醛固定后，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。第四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片

石蜡切片：优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。冰冻切片：优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。缺点：不易保存（-800C）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成抗原的弥散使定位不准确。

第五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五二、抗原的保存与修复抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。第六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五常用的方法有：

酶消化法：胃蛋白酶、胰蛋白酶和无花果酶盐酸水解暴露抗原法：注意温度和时间微波炉恢复抗原法：微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质之间的交联健，从而使抗原修复。高压锅恢复抗原法煮沸恢复抗原法抗原修复液中的化学成分或离子与部分抗原表位结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。高温可以使某些已经封闭的抗原表位得以重新暴露和修复第七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五第八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五三、抗体的处理与保存（一）抗体的选择注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低（二）抗体的稀释抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度第九页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（三）抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低第十页，共六十九页，编辑于2023年，星期五(三）阴性结果和抗原不表达（五）免疫组化结果与HE染色结果(一）必须设立对照（二）阳性结果（四）特异性染色与非特异性染色四、免疫组化的结果判断第十一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五确证实验

(一）必须设立对照空白实验替代试验吸收或阻断试验对照实验：

阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明显示程序正确，尤其实验结果呈阴性时更为重要）阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）第十二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五确证实验：

空白实验：PBS（排除内源性酶）

替代试验：同一动物免疫前的非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特异性反应）（这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。）

吸收或阻断试验：用过量的已知抗原与特异性抗体反应，本已经是阳性的标本应呈阴性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原抗体反应。）第十三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五显色分布:（二）阳性结果可以作为判定抗原定位的依据（三）阴性结果及抗原不表达第十四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（四）特异性染色与非特异性染色

特异性染色

非特异性染色分布在特定的部位，显色不均一无分布规律，均匀显色特异性染色非特异性染色分布在特定的部位,具结构性无分布规律，常出现在切片边缘、刀痕或皱折部位及坏死或挤压的细胞区域由于细胞内抗原含量不同，所以显色不均一不限于单个细胞，而是累及一片细胞，均匀显色阳性与阴性细胞相互交杂，同一切片上显色强度不一细胞和周围的结缔组织均无区别的着色第十五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五出现假阴性的原因第十六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五出现假阳性的原因第十七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（五）免疫组化结果与HE染色结果第十八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五五、质量控制（一）试剂质量控制

抗体特异性、敏感性测试,抗体最佳稀释度的选择,稀释剂,抗体孵育温度、时间非特异性染色：缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。（二）仪器的质量控制相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒第十九页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（三）操作过程质量控制操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差第二十页，共六十九页，编辑于2023年，星期五★酶免疫组织化学技术酶标记已知抗体（抗原），与标本中靶抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，在显微镜下识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。第二十一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五标本处理与荧光免疫相似标本可长期保存，可用普通显微镜观察分类酶标记抗体免疫组化非标记抗体酶免疫组化一、组织处理

第二十二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五★原理

酶直接标记在抗体上，与靶抗原反应，通过酶对底物的特异性催化作用，产生的有色物质沉积在靶抗原部位，从而对靶抗原定位、定性和定量检测。二、酶标记抗体免疫组化染色第二十三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五直接法抗原标本载玻片优点：操作简便、特异性高缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦标记抗体底物第二十四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五标记二抗体间接法抗原优点：敏感度高缺点：特异性偏低,操作繁琐底物第二十五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五★原理

用酶免疫动物制备抗酶抗体，再将组织抗原与抗酶抗体结合形成复合物，通过酶的底物显色而检测抗原，避免了用酶标记时对抗体的损伤，提高了检测敏感性。PAP法酶桥法

双桥PAP法APAAP法三、非标记抗体酶免疫组化染色第二十六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（一）酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色第二十七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

抗酶抗体抗原优点：敏感性比酶标法高缺点：操作繁琐底物酶桥法桥抗体酶第二十八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

优点：

敏感性较酶标法有所提高

缺点：

操作分四步，较复杂如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性

+++HRP底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源抗酶抗体/Ab3Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物AgAgAgAg第二十九页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（二）PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物)

第三十页，共六十九页，编辑于2023年，星期五抗原底物PAP法桥抗体

PAP复合物第一抗与第三抗的动物种属须相同第三十一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五操作只需三步

PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端大大减弱背景着色①桥连抗体存在的非特异性抗体，因其与第1抗体并非同种属，不能与抗酶抗体结合②抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不能与酶结合，不会有酶活性。+++底物二抗/Ab2兔源一抗/Ab1Ag兔源PAP复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-PAP复合物第三十二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（三）双桥PAP法基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。第三十三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

抗原底物双桥PAP法桥抗体第一抗与第三抗的动物种属须相同

PAP复合物第三十四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物常用种类:

辣根过氧化物酶/HRP底物显色（DAB)棕色或灰蓝色(AEC)最常用

碱性磷酸酶/AP

底物显色玫瑰红色(α-萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色(α-萘酚磷酸盐与快蓝反应）;靛蓝四唑（紫蓝色）最敏感

葡萄糖氧化酶/GO

底物为葡萄糖，配以NBT和PMS显色蓝色敏感性较低，显色底物不易保存

β-半乳糖酶等酶的选择:

HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为APAP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰第三十五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

采用荧光素标记已知抗体（或抗原）作为探针，检测标本中靶抗原（或抗体），在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。★荧光免疫组织化学技术第三十六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五一、组织的处理标本的类型：涂片和印片组织切片细胞培养标本活细胞标本的保存：标本固定干燥后，最好立即检测保持干燥、置4℃甚至-20℃以下保存第三十七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五二、荧光免疫组化染色

直接法：优点：操作简便、特异性高

缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦

间接法：

优点：较直接法灵敏，标记一种抗体可以鉴定多种抗原

缺点：非特异荧光、操作时间较长

第三十八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五双标记荧光免疫染色法用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时检测

标记抗体A抗原A抗原B标记抗体B标本载玻片第三十九页，共六十九页，编辑于2023年，星期五亲和组织化学（Affinityhistochemistry）

利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（与蛋白糖基）、生物素（亲和素）和葡萄球菌A蛋白（IgGFC段结合）等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。第四十页，共六十九页，编辑于2023年，星期五待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶ABC直接法原理示意图原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。（一)亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC第四十一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五ABC间接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化第二抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。第四十二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理

ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合，亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合

优点：

敏感性高特异性高一抗和二抗工作浓度低操作时间缩短可以多重标记第四十三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五(二）桥联亲合素-生物素技术

BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB

原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素(酶标生物素)联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。第四十四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五BRAB直接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶第四十五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五BRAB间接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶第四十六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（三）标记亲和素-生物素技术

LabelledAvidin-biotintechnique，LAB原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:

相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高检测灵敏度第四十七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五二、葡萄球菌A蛋白法定义:葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物（人、猪、兔、小鼠等）IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验第四十八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五注意：SPA对IgG

亚型的结合有选择性（如IgG3不结合），不结合IgA1,可能出现的假阴性结果。优点：解决不同动物样本检测时，需分别标记相对应的二抗的问题。第四十九页，共六十九页，编辑于2023年，星期五三、凝集素法凝集素lectin

是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素，凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具，凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。第五十页，共六十九页，编辑于2023年，星期五间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应。糖-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。第五十一页，共六十九页，编辑于2023年，星期五四、链霉亲合素-生物素法(LSAB）

链霉亲合素(StreptavidinSA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法第五十二页，共六十九页，编辑于2023年，星期五LSAB法具有几大特点：可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法低背景着色操作时间缩短第五十三页，共六十九页，编辑于2023年，星期五

免疫电子显微镜（ImmunoelectronMicroscope，IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。

特点:

定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点一、免疫标记电镜技术的原理第五十四页，共六十九页，编辑于2023年，星期五标本制备的要求是保存良好的细胞超微结构，注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。二、免疫标记电镜技术标本的制备要求第五十五页，共六十九页，编辑于2023年，星期五第五十六页，共六十九页，编辑于2023年，星期五从动物到电镜照片第五十七页，共六十九页，编辑于2023年，星期五（—）免疫胶体金染色法

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。它在弱碱环境下可与蛋白质分子形成牢固的静电结合而不影响蛋白质的生物特性。三、常用的免疫标记电镜技术第五十八页，共六十九页，编辑于2023年，星期五免疫金银法

(ImmuNogoldsilvertechNiqueIGST)。其基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片，冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片，该法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确，