DB21T 3378-2021辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程

ICS65.020.01CCSB16DB21辽宁省地方标准DB21/T3378—2021辽宁省松材线虫病检验鉴定技术规程TechnicalregulationonquarantineforthepinewiltdiseaseinLiaoningprovince2021-01-30发布 2021-03-02实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3378—2021DB21/T3378—2021#附录G(资料性)

分子生物学鉴定G.1松材线虫PCR检测G.1.1线虫基因组DNA的提取制作线虫裂解液(200mmol/LTris-HCl、200mmol/LNaC1、100mmol/LEDTA、2%SDS、2%6-mercaptoethanol、200^g/mL蛋白酶K),预冷线虫裂解液，按照10应线虫裂解液：1条线虫比例，将线虫与裂解液置于离心管中。置于PCR仪，70r条件下保温处理35min,在95°C条件下保温处理10min后，12000/min离心2min,取上清液。G.1.2反应体系每反应的混合液总体积为20pL,其中：2.0应10x快速TaqPCR缓冲液；2应2.5mmol/L的dNTP；0.3应快速扩增Taq酶；1.5应10mmol/L的引物组合B；2.0应的模板DNA；补充高压灭菌重蒸水至20pL。G.1.3反应程序反应混合液在98°C预变性5s,进入循环98°C变性3s,52°C退火3s,72°C延伸40s,共30个循环，最后72。延伸211血1。G.1.4结果检测PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为IxTAE或IxTBE,电压为5V/cm,电泳时间为30min。置凝胶于302nm透射紫外灯上观察，拍照。结果参见图G.1。图G.；松材统虫电泳检测图谱注：泳道M-标准DNA；47-49松材线虫；50-52拟松材线虫G.2松材线虫自动化分子检测G.2.1松材线虫病试剂盒组成成分名称数量成分DNA提取试剂A液2ml/管xl管松材线虫裂解缓冲液DNA提取试剂B液200卩1/管xl管松材线虫消化酶pCR扩增混合K液500卩1/管xl管含TaqDNA聚合酶，dNTP的溶液PCR扩增混合P液150卩1/管xl管特异性引物、探针线虫DNA阳性质控Y液75卩1/管xl管松材线虫DNA片段阴性质控C液1ml/管xl管无酶水G.2.2适用设备松材线虫自动化分子检测系统48，松材线虫自动化分子检测系统48A,松材线虫自动化分子检测系统mini等松材线虫荧光定量PCR检测系统。G.2.3检测方法将分离的线虫置于1.5mL悬浮液离心浓缩，取底部液体20pL,加入A液20应,B液2pL；金属浴中65°C,40min, 95°C,10min； 12000r/min离心3min,取上清液（线虫DNA溶液）。G.2.4反应体系样品：线虫DNA溶液3.5应，加入K液5应，P液1.5应。阳性对照：线虫DNA阳性质控Y液3.5应，加入K液5应，P液1.5应。阴性对照：阴性质控C液3.5应，加入K液如L,P液1.5应。G.2.5反应程序将样品、阳性对照及阴性对照放入机器，选择仪器中松材线虫自动检测程序。G.2.6反应结果松材线虫自动化分子检测系统采用自动程序判读检测结果，如表G.1、G.2。表G.1松材线虫自动化分子检测结果序号颜色苗品来源Ct值判定结果11A125.83含松材线虫2120.23含松材线虫31A328.47含松材线虫41A4”：23.19含松材线虫51A527.38.含松材线虫61A621.28、含松材线虫71阳性对照16.65含松材线虫81阴性对照不含松材线虫

表G.2松材线虫自动化检测结果表G.2松材线虫自动化检测结果G.3实时荧光PCR检测G.3.1检测仪器实时荧光PCR仪、高速冷冻离心机。G.3.2引物与探针松材线虫的引物正向引物序列：5'-GAGCAGAAACGCCGACTT-3'；反向引物序列：5'-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3'；TaqMan探针序列：5'-TGCACGTTGTGACAGTCGT-5'。G.3.3反应体系反应的混合液总体积为20卩L,其中:TaqMan通用PCR预混液10卩L；1011mol/LTaqMan探针1.0UL；10umol/L正向引物Q.5uL；10umol/L反向弓卜物0.5uL；模板DNA1.OuL；ddH207.OuL；G.3.4反应程序反应混合液在95°C预变性lOmin；进入循环95°C变裡15s,60°C运行35s,共35个循环。G.3.5检测结果循环阈值(Cyclethresholdvalue)Ct值：是在PCR扩增过程中，荧宪信号*暫由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，是实时荧光定量PCR检测结果判读的依据。当检测样品30>Ct>12时，含有松材线虫；Ct>35或者无Ct值，不含松材线虫；35>Ct>30,可能岀现假阳性，应重新检测。DB21/T3378—2021DB21/T3378—2021附录H（规范性）松材线虫分子生物学检验送检表表