菌种的制备和保藏1

第一节微生物的生长繁殖1目前一页\总数四十三页\编于二点生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖一、生长与繁殖的概念2目前二页\总数四十三页\编于二点二、细菌的繁殖一般为无性繁殖，二分裂法。同形裂殖：裂殖后形成的子细胞大小相等。异形裂殖：分裂产生两个大小不等的子细胞。细菌分裂过程：①菌体伸长，核质体分裂②形成横隔壁③子细胞分离无性繁殖有性繁殖☆少数有菌毛的菌可进行有性繁殖方式3目前三页\总数四十三页\编于二点三、放线菌的生长繁殖4目前四页\总数四十三页\编于二点★由分枝状菌丝组成。菌丝无隔膜，仍属单细胞。菌丝直径与杆菌相似（1m左右）；细胞壁含磷壁酸、二氨基庚二酸，不含几丁质、纤维素；革兰氏阴性。1、放线菌的形态构造★菌丝根据形态和功能不同可分为：

基内菌丝(Substratemycelium）气生菌丝(Aerialmycelium)孢子丝(Reproductivemycelium)5目前五页\总数四十三页\编于二点2、放线菌的繁殖方式6目前六页\总数四十三页\编于二点四

霉菌的繁殖方式7目前七页\总数四十三页\编于二点)：1.孢囊孢子（sporangiospore）形成特征：形成于菌丝的特化结构——孢子囊内。孢子形态：近圆形。举例：根霉、毛霉。8目前八页\总数四十三页\编于二点2.分生孢子(Canidinm):形成特征：由分生孢子梗顶端细胞特化而成的单个或簇生的孢子。孢子形态：极多样。举例：曲霉、青霉。9目前九页\总数四十三页\编于二点3.节孢子(arthrospore，又称粉孢子)形成特征：由菌丝断裂而成。孢子形态：常呈成串短柱状。举例：白地霉。10目前十页\总数四十三页\编于二点厚垣孢子4.厚垣孢子（Chlamydospore)形成特征：部分菌丝细胞质浓缩、变圆，周围生出厚壁而成。孢子形态：圆形、柱形等。举例：总状毛霉。11目前十一页\总数四十三页\编于二点有性结构及其形态特征：由大小不同的配子囊结合后发育而成。小配子囊称雄器；大配子囊称藏卵器。所属分类地位：卵菌纲。1.卵孢子（oospore)12目前十二页\总数四十三页\编于二点2.接合孢子（zygospore):有性结构及其形态特征：

是由菌丝生出的结构大小相似、形态相同或略有不同两个配子囊接合后发育而成。所属分类地位：接合菌纲接合孢子形成过程:13目前十三页\总数四十三页\编于二点3.子囊孢子（ascospore):有性结构及其形态特征：在子囊中形成。子囊：两性细胞接触以后形成的囊状结构。子囊的形成有两种方式：①两个营养细胞直接交配而成，其外面无菌丝包裹；②从一个特殊的、来自产囊体菌丝（称为产囊丝）的结构上产生子囊，多个子囊外面被菌丝包围形成子实体，称为子囊果。所属分类地位：子囊菌纲14目前十四页\总数四十三页\编于二点4.担孢子(basidiospore)有性结构及其形态特征：担子菌所特有，经两性细胞核配合后产生的外生孢子。因着生在担子上而得名。所属分类地位：担子菌纲15目前十五页\总数四十三页\编于二点五、微生物生长的测定方法描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，堆体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）16目前十六页\总数四十三页\编于二点1.涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取

0.01ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代

入公式：

每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数17目前十七页\总数四十三页\编于二点原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。2.血球计数板法18目前十八页\总数四十三页\编于二点2.血球计数板法19目前十九页\总数四十三页\编于二点3.比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。20目前二十页\总数四十三页\编于二点4.平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作★Astandardplatecount(viablecount)reflectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony;platecountsarereportedasnumberofcolony-formingunits(CFU)perml(CFU/ml)orperg(CFU/g)ofsample.21目前二十一页\总数四十三页\编于二点4.平板菌落计数法22目前二十二页\总数四十三页\编于二点六、微生物的群体生长☆无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，☆由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（Ｇenerationtime,G），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间，有时也称为倍增时间。☆右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。1.无分支单细胞微生物的群体生长特征23目前二十三页\总数四十三页\编于二点将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。生长曲线的制作24目前二十四页\总数四十三页\编于二点典型的生长曲线

（Growthcurve）延滞期对数期稳定期衰亡期时期的划分：按照生长速率常数（growthraceconstant）不同25目前二十五页\总数四十三页\编于二点其它名称：停滞期、调整期、适应期1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：生长速率常数=0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物①.延滞期（lagphase）26目前二十六页\总数四十三页\编于二点◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；◆培养基成分：

在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；

接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。★影响延迟期长短的因素：27目前二十七页\总数四十三页\编于二点认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短lagphase的措施有：①增加接种量；（群体优势----适应性增强）②采用对数生长期的健壮菌种；③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。④选用繁殖快的菌种◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌28目前二十八页\总数四十三页\编于二点②.对数期（logarithmicphase）其他名称：指数期现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。

特点：生长速率常数最大，即代时最短细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素：菌种营养成分营养物浓度﹡培养温度29目前二十九页\总数四十三页\编于二点应用意义：①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。30目前三十页\总数四十三页\编于二点营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间细胞数或菌体量31目前三十一页\总数四十三页\编于二点③.稳定期（stationaryphase）又称：恒定期或最高生长期特点：①新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：

营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调，如碳氮比不合适;有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;32目前三十二页\总数四十三页\编于二点应用意义：1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）调pH

调整温度2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。生长产量常数（Y，或生长得率，growthyield）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低

Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度

根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C033目前三十三页\总数四十三页\编于二点④.衰亡期（declinephase）特点：①细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。②细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡34目前三十四页\总数四十三页\编于二点lg细胞数或产物浓度时间细胞产物I型 II型3.微生物生长与代谢产物形成的关系微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。35目前三十五页\总数四十三页\编于二点第二节固体孢子制备

固体孢子是生产种子的一种形式。抗生素生产中选用哪一种种子形式进罐完全取决于菌种的遗传特性。一般繁殖能力强，孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。固体孢子进罐优于菌丝进罐。因为分生孢子处于半休眠状态，细胞内的代谢活动降到最低点。进种子罐后，每个个体都从同一水平起步生长繁殖。因此可以取得同步生长或接近同步生长。后代菌丝繁殖也比较一致。进罐前的固体孢子如能在水中浸泡数小时，使进罐后有利于孢子发芽，更能取得同步生长的效果。36目前三十六页\总数四十三页\编于二点孢子的扩大繁殖可经过斜面培养基生长或谷物固体培养基生长，需视菌种特性和生产工艺的需要而定。种子采用固体孢子直接进种子罐的抗生素品种有青霉素、土霉素、四环素、麦迪霉素等。37目前三十七页\总数四十三页\编于二点一、不同菌种的固体孢子制备工艺

以四环素生产菌种的斜面孢子制备为例。四环类抗生素产生菌的分生孢子繁殖迅速，孢子数量多。每支茄子瓶斜面的生长周期为3～4d，孢子总数为(50～100)亿以上。已能满足进罐孢子数的要求。因此采用斜面孢子制成孢子悬液直接进罐的种子工艺。四环素生产菌种的固体孢子制备工艺如下。38目前三十八页\总数四十三页\编于二点

1．斜面培养基(％)麸皮3.2，(NH4)2HP040.015，MgS040.005，琼脂2.2，KH2P040.0l，装量60mL(每个茄子瓶)。

2．斜面孢子培养接种斜面后于35℃恒温室培养100h。培养室内的空气湿度不得低于30％，以保证菌丝和孢子的正常生长。39目前三十九页\总数四十三页\编于二点培养成熟的斜面孢子每瓶加无菌水40～5